Memelilerde Dozaj Telafisi

Oxford Üni.'den N.Brockdorff ile Birmingham Üni.'den B.M.Turner'ın 2015'te yayımlanan ve eşey kromozomlarındaki genlerin ifadelerinin eşitlenmesini konu alan makalesinin Türkçe çevirisini sunuyoruz. ..
Görsel Telif:

Öz

Organizmaların çoğunda, cinsiyetler arasında önemli kromozomal farklılıklar bulunur. Memelilerde dişiler büyük, gen-zengini bir kromozom olan X’ten iki kopya taşırken, erkekler tek bir X ile küçük, gen-fakiri bir Y taşır. Birkaç yüz adet genin ifadesindeki dengesizlik, dozaj telafisi yapılmadığı takdirde ölümcül olur. Dişinin X’lerinden birinin gelişimin erken aşamalarında susturulmasıyla, erkek-dişi farklılığının üstesinden gelinir. Ancak bu durumda hem erkekler hem de dişiler tek bir etkin X kromozomuna sahip olmuş olur. Bu durum, etkin X’teki genlerin iki misli yukarı-regülasyonu ile telafi edilir. Bu karmaşık sistem, epigenetik düzenleme (regülasyon) mekanizmaları hakkında önemli kavrayışlar sağlamayı sürdürmektedir.

Genel Bakış

Pek çok başka organizmada olduğu gibi, memelilerde de cinsiyetler arasında önemli bir kromozomal fark vardır. Örneğin insanlar, hem erkeklerde hem de dişilerde bulunan ve otozomlar olarak bilinen 22 çift kromozom taşır; her bir çiftin bir üyesi anneden, bir üyesi de babadan kalıtılmıştır. Ama iki başka kromozom daha vardır; cinsiyetler arasında farklılık gösteren, X ve Y adlarındaki eşey kromozomları. Dişilerde iki X varken, erkeklerde bir X ve bir Y olur. Bu önemlidir çünkü X’in 1000’den fazla gen taşıyan orta büyüklükte bir kromozom olmasına karşın, Y küçüktür ve çok az gen taşır. Benzer bir durum, kemirgenler ve keseliler de dahil olmak üzere diğer memelilerde de mevcuttur. Kromozomal farklılıklar, cinsiyetlerin belirlenme mekanizmasıyla ilgilidir ve milyonlarca yıllık bir süreçte evrilmiş görünmektedir.

Eşey kromozomu dengesizliği, organizmayı bir sorunla karşı karşıya bırakır: İki cinsiyet, X-bağlantılı genlerin kopya sayısı bakımından farklıdır. Bu durum, gen ürünlerinde (RNA’lar ve proteinler) bir dengesizliğe yol açabilir; dolayısıyla, metabolik kontrolde ve diğer hücresel süreçlerde farklılıklar gerektirir. Bundan kaçınmak için, cinsiyetler arasında X-bağlantılı gen ürünlerinin düzeyini dengeleyen dozaj telafisi mekanizmaları evrilmiştir. Bunun gerçekleştirilebileceği üç genel yöntem bulunur: Birincisi, erkeklerde X-bağlantılı gen ifadesinin iki misli yukarı-regülasyonudur; ikincisi, dişilerde X kromozomlarının ikisindeki genlerin de iki misli aşağı-regülasyonudur; üçüncüsü, dişilerde X’lerden birinin tümüyle etkisizleştirilmesidir. İlk strateji meyve sineği Drosophila (bkz. Lucchesi & Kuroda 2014), ikincisi kurtçuk Caenorhabditis elegans (bkz. Strome et al. 2014) ve şu anda göründüğü kadarıyla hem birinci hem de üçüncü strateji memeliler tarafından benimsenmiştir.

Memelilerde dozaj telafisi konusunda son yıllarda yapılan çalışmalar, temel epigenetik mekanizmalara ve gen ifadesi şablonlarının gelişim boyunca nasıl düzenlendiğine ilişkin önemli kavrayışlar sağlamıştır. Bu aydınlatıcı çalışmaların süreceği güvenle öngörülebilir.

1. Giriş

1.1. Cinsiyet Belirlenimi, Dozaj Telafisi Gereksinimi Doğurur

Eşeyli üreme, ökaryotlar arasında yaygındır. Kök filizleri ve sürgünler vererek, eşeysiz olarak gayet iyi çoğalabilen bitkiler bile sıklıkla alternatif bir eşeyli üreme moduna sahiptir. Olası bir açıklama, eşeyli üremenin, doğal seçilimin üzerinde işleyebileceği genetik çeşitlenebilirliğe büyük bir artış getirmesidir. Eşeyli üremeyle ortaya çıkan her nesilde oluşan allel karılması, eşeysiz üreme yöntemleriyle türemiş nispeten homojen bir topluluğa kıyasla, çevresel değişimlerle daha iyi başa çıkabilecek bir topluluk üretir. Ama eşeylilik karmaşıktır; erkek ve dişi eşey organlarını oluşturan gelişimsel yolakların yanı sıra, mayoz, üreme hücresi olgunlaşması, eşlerin cezbedilmesi ve çiftleşme için lâzım olan fizyolojik ve biyokimyasal teçhizatı gerektirir (bkz. Marshall Graves & Shetty 2001).

Farklı cinsiyetleri tanımlamada kullanılan genetik mekanizmalar, organizmadan organizmaya büyük ölçüde değişir. En basit sistem, cinsiyetlerden birinde homozigot (“homogametik” cinsiyet), diğerinde heterozigot (“heterogametik” cinsiyet; Fig.1) olan tek bir lokus şeklindedir. Bu sistem, farklı organizmalarda çeşitlilik gösteren karmaşıklık düzeylerine ulaşmak için farklı yollarla evrilmiştir. Bazılarında, heterogametik cinsiyette cinsiyet belirleyen allellerin mayotik rekombinasyonunu (karşılıklı-geçişim, krosing-over) baskılayan mekanizmalar devreye sokulmuştur (Fig. 1); bu, cinsiyetler-arası durumlara yol açan allel karışımları neslini önlemeye yardım eden bir adımdır. Rekombinasyon yetisinin yokluğu, çoğu durumda, bir kromozomu kısmen veya tamamen kaplayacak şekilde yayılmıştır ve beraberinde genetik bilgi yitimi eşlik eder. Bu kromozom dejenerasyonuna yol açan evrimsel baskılar hâlâ anlaşılmayı beklemektedir ama çoğu türde nihai sonuç, iki cinsiyetin sadece bir ya da birkaç lokustaki allellerde değil, tüm bir kromozomda farklılık göstermesidir. Memelilerde dejenere kromozomu taşıyan erkek, kuşlarda ise dişidir (Marshall Graves & Shetty 2001).

Figür.1: Y kromozomunun evrimi. Evrimin erken evrelerinde, iki cinsiyet sadece tek bir, otozomal lokus (siyah kutucukla gösteriliyor) bakımından farklı olmuş olabilir; cinsiyetlerden biri bu lokus bakımından homozigot (dişi) ve diğer cinsiyet (erkek) heterozigot (proto-erkek olarak gösteriliyor) olmuştur. “Erkek-belirleyici allel” sarı renkle gösterilmiştir. Eğer çiftleşme her cinsiyetin bir üyesini gerektiriyorsa, o zaman erkek-belirleyici allel bakımından homozigot olan bireyler ortaya çıkamaz. Bu erken evrede, cinsiyetler arasındaki fizyolojik farklar çok hafiftir; mayadaki iki eşleşme tipini (İng. mating type) ayıranlarla kıyaslanabilirdir. Cinsiyetler-arası durumların oluşumunu önlemek için, erkek-belirleyici lokusun (koyu gölgeleme) içinde ve ertrafında karşılıklı-geçişim (kros-over) baskılanacaktır. Silinmeler ve ters çevrilmeler de dahil olmak üzere mutasyonlar birikecektir ve karşılıklı-geçişimin baskılandığı dejenere bölgenin yavaş yavaş genişlemesine neden olacaktır (Müller’in mandalı); ta ki kromozom aktif, işlevsel genlerinin çoğunu yitirene dek. (Mutasyonlar birikir çünkü karşılıklı-geçişimin baskılanması, onların homozigot formda görülme olasılığını azaltarak, onlara karşı seçilim baskısını düşürür.) Mayozda çiftlenmeye ve karşılıklı-geçişime olanak sağlaması için X kromozomuna homolog olan küçük, aktif bir bölge kalmalıdır (gri bir x ile gösterilmiştir). Bu bölge sanki-otozomal bölgedir (İng. pseudoautosomal region – PAR). Başlangıçta gelecekteki X ile homolog olan otozom (diyagramdaki A), vaşka kromozomlardan translokasyonlar yoluyla bazen kendi kendine evrilir (kırmızı gölgeleme); sonunda ayrı bir X kromozomu oluşturur. Bu X, diğer kromozomlar gibi, evrimsel süreçte farklı aralıklarla yerleşmiş DNA parçalarının bir mozaiğidir. Bazıları antikken, bazıları nispeten yenidir. İnsan X’inde daha yeni gelenler, X inaktivasyonundan kaçan genlerle zenginleştirilmiştir.

Cinsiyetsel farklılaşma genellikle bir ya da birkaç tane kritik genin gelişim sırasında açılması veya kapatılmasıyla tetiklenir. Bu genlerin ürünleri, cinsiyet belirlenim yolaklarından birine veya diğerine doğru ilerlemeyi belirten gen düzenleyici olaylar çağlayanı başlatır (bkz. C. elegans için Strome et al. 2014; bkz. Drosophila için Lucchesi & Kuroda 2014). İnsanlarda, erken evre embriyoyu erkek yolağına doğru iten, Y kromozomu üzerindeki SRY geninin protein ürünüdür (Quinn & Koopman 2012). Bu türden bir mekanizmanın başarıyla işlemesi için büyk kromozom farklılıklarına gereksinimi yoktur; öyleyse neden böyle farklılıklar bu kadar sık ve memelileri, kuşları, meyve sineklerini kapsayan bu kadar çeşitli organizmada ortaya çıkar? Belki de, cinsiyetler-arası durumları önlemek için gereken karşılıklı-geçişim (krosing-over) baskılanmasının bir yan ürünü olarak ortaya çıkıyorlardır (Fig. 1). Allellerin topluluklarda yayılımını etkileyen etkenlerin matematiksel çözümlemesi, karşılıklı-geçişimin baskılanmasının, karşılıklı-geçişim baskılanma bölgesi çevresinde zararlı mutasyonların kademeli birikimine kaçınılmaz olarak yol açacağını göstermiştir. Bunun nedeni büyük ölçüde böyle mutasyonların ender olarak homozigot hâle gelmeleridir; ki elenmeleri için öyle olmaları gerekir. Silinmeler (delesyon) ve yer değiştirmeler (translokasyon) dahil olmak üzere mutasyonlar, başlangıçtaki baskılanmış bölgenin ötesine kademeli olarak yayılarak, başlangıçta homolog olan iki kromozomdan birinde ilerleyen dejenerasyona yol açar (Fig. 1). Geriye çevrilmesi olanaklı olmayan bu dejeneratif sürece, bu durumu ilk olarak gündeme getiren ve matematiksel olarak modelleyen genetikçinin anısına “Müller mandalı” (Müller’in çark mandalı) adı verilir. Bu süreç için seçilim yoktur; üreme için iki-cinsiyetli bir stratejinin benimsenmesinin gerekli kıldığı yerel karşılıklı-geçişim baskılanmasının bir sonucu olarak gerçekleşir (Charlesworth 1996; Charlesworth & Charlesworth 2005). Ama kromozom dejenerasyonunun arkasındaki evrimsel itki ne olursa olsun, gerçekleşmiş (ve muhtemelen gerçekleşmekte) olduğu gerçeği, iki olası sorunla başa çıkacak mekanizmaların birlikte-evrimini gerektirir: Birincisi, aynı türün üyeleri arasında büyük bir kromozomal fark vardır ve ikincisi, heterogametik cinsiyet büyük bir kromozom bakımından monozomiktir ve dolayısıyla çok sayıda gen bakımından monoalleliktir. Dozaj telafisi mekanizmaları ile bu meselelerin ikisinin de üstesinden gelinmesi gerekir.

1.2. Erkek Sorununu Çözmek: X-Bağlantılı Genlerin Yukarı-Regülasyonu

Memelilerde ve Drosophila‘da erkekler her bir cinsiyet kromozomundan birer kopya, yani bir X ve bir Y taşırken, dişiler X’ten iki kopya taşır. Her iki organizma grubunda da Y gen fakiridir ve büyük ölçüde heterokromatiktir. Erkek gelişimi veya doğurganlık için gereken birkaç tane gen içerir. X ise tersine büyük, gen zengini bir kromozomdur. Tüm organizmalarda gen ürünleri (RNA’lar ve proteinler), hücre başına gen kopyalarının sayısıyla doğru orantılı üretilir. Dolayısıyla, bir veya iki X kromozomunun varlığı, çok sayıda gen ürünün hücre-içi derişimlerinde, cinsiyetlar arasında iki katlık bir farka neden olacaktır. Bunun da ötesinde, XY erkekler X-bağlantılı genlerin büyük bir çoğunluğu bakımından monoalleliktir (sadece birkaç genin Y veya otozomlar üzerinde homologları vardır). Yüksek ökaryotların genellikle bir kromozomun bir kısmının bile yitimine tolerans gösteremedikleri düşünülürse, bu şaşırtıcıdır; küçük kromozom silinmeleri genellikle büyük deformasyonlara neden olurken, otozomal monozomiler neredeyse her zaman ölümcüldür. O hâlde nasıl oluyor da, erkekler sadece tek bir X kromozomuyla sağ kalabiliyor?

Bu soruyu yanıtlamaya çalışırken, hücrelerin ve organizmaların münferit genler için monoallelliği oldukça iyi tolere edebildiklerinin farkında olmak önemlidir. Örneğin, bir enzimin inaktif formunu kodlayan bir allel taşıyan ve dolayısıyla aktif enzimin normal düzeyinin sadece yarısına sahip olan heterozigot bir birey genellikle gayet sağlıklıdır; ancak kusurlu allelde homozigotluk ölümcül olabilir. Bununla birlikte, bazı genlerin doza diğerlerinden daha duyarlı olduğu bellidir. Yapılan son çalışmalar, büyük multiprotein komplekslerinin bileşenlerini kodlayan genlerdeki iki katlık bir dozaj değişiminin, fenotipik bir etki yaratmasının özellikle olası olduğuna işaret etmiştir (Pessia et al. 2012). Ayrıca, “çok sayıda” (İng. multiple) gen ürününden normal düzeyin yarısı kadarına sahip olmanın kümülatif bir etkisi de vardır. Örneğin, bir metabolik veya sinyalleme yolağının çeşitli bileşenlerinin hepsi iki kat azaltılırsa, o yolağın son ürünü iki kattan fazla azalış gösterebilir ve fenotipik etkiler yaratabilir (Fig. 2) (Oliver 2007). O hâlde, hem kendileri doza duyarlı olan X-bağlantılı genlerin yitimi, hem de kendileri doza tahammüllü olan ama toplu olarak pek öyle olmayan genlerin gitgide artan yitimi yoluyla, proto-Y kromozomu evrimsel süreçte dejenerasyona uğrarken, heterogametik cinsiyet için sorunlar kaçınılmaz şekilde birikecektir (Fig. 2).

Figür.2: Varsayımsal bir sinyalleme yolağı üzerinde X-bağlantılı allellerin aşamalı yitiminin etkileri

Erkeklerin yüz yüze kaldığı sorun, 40 yıldan uzun bir süre önce genetikçi Susumu Ohno tarafından fark edilmiştir; kendisi, erkeğin tek X kromozomundaki genlerin ifadesinin iki misli yukarı-regülasyonuyla sorunun çözülebileceğini tahmin etmiştir (Ohno 1967). Ohno ayrıca bunun evrimsel süreçte, her seferinde bir gen temelinde gerçekleşebileceğinden söz etmiştir. Elbette doza duyarlı (veya bazı üyeleri zaten yitirilmiş bir yolaktaki) bir genin yitimi, geriye kalan gen kopyasının ifadesinin yukarı-regülasyonu (yani telafisi) yönünde güçlü bir seçilim baskısı ile sonuçlanacaktır. Bununla birlikte, eğer erkek (heterogametik, XY) cinsiyet bu stratejiyi benimseyecek olursa, türün dişi (homogametik, XX) üyeleri için sorunlara neden olur; o zaman dişilerin, ifadeleri iki misli “yükselmiş” olan artan gen sayılarıyla başa çıkması gerekir. O hâlde, dişi memelilerdeki X kromozomlarından birinin susturulması (bu makalenin büyük bölümünün konusu bu), söz konusu aşırı-ifadelenmeye bir yanıt olabilir.

Ohno’nun düşüncesinin genel geçerliliği, meyve sineği Drosophila melanogaster‘da dozaj telafisi üzerine yapılan çalışmalarla tesis edildi; söz konusu araştırmalarda genetik, biyokimyasal ve son çıkan yüksek-çıktılı gen ifadesi çalışmaları, XY erkeklerde X-bağlantılı genlerin yukarı-regülasyonu yoluyla dozaj telafisinin gerçekleştiğini doğruladı (Lucchesi & Kuroda 2014). Önemli bir nokta şu ki, sinekte evrilen mekanizmada yukarı-regülasyon sadece erkeklerde görülerek, XX dişilerdeki aşırı-ifadelenme sorununu es geçer. Ohno’nun hipotezinin memelilerde ayrıntılı olarak incelenmesi için çok sayıda genin ifadesini doğru şekilde değerlendirebilen yöntemlerin geliştirilmesini beklemek gerekti. Çünkü tek tek genlerin yazım düzeylerini değerlendirmek, ne kadar doğruluklu yapılsa da, genin yukarı-regülasyonunun yapılıp yapılmadığını belirleyemez. Genler, ifadelenme düzeyleri bakımından birbirlerinden çok büyük farklılıklar gösterirler; aynı bir genin ifadelenmesinde bile, bulunduğu doku ya da hücre tipine ve gelişim aşamasına bağlı olarak, hatta aynı hücrede zaman içinde sıklıkla değişiklik görülür. O zaman belli bir genin iki misli yukarı-regüle edilip edilmediğini nasıl bilebiliriz? Dayanağımız nedir?

Son çıkan teknolojiler, ilk mikro-diziler ve şimdi yüksek-çıktılı RNA dizileme, çok sayıda genin ifadesini değerlendirebilir ve belli bir dokuda ya da hücre tipinde, erkeklerdeki X-bağlantılı genlerin “toplamdaki” ifadesinin (yani hepsinin ifade düzeylerinin net sonucunun), otozomal genlerinkinden daha yüksek olduğu iddiasını sınamamıza olanak tanır. Eğer X’ten bir tane, her bir otozomdan ise iki tane taşıyan erkeklerde, X-bağlantılı genlerin ifadesinin otozomal genlerin ifadesine oranı 0,5 ise yukarı-regülasyon yok demektir; yani ifadelenme düzeyleri gen kopyası sayısını yansıtır. Öte yandan, eğer oran 1,0 ise iki misli yukarı-regülasyon var demektir ve Ohno’nun hipotezi doğrulanmış olur (Fig. 3).

Figür.3: X-bağlantılı genlerin seçilimsel yukarı-regülasyonunun neden olduğu medyan ifadelenme kayması.

Yaklaşık son 5 yılda, mikro-dizi verilerini (Nguyen & Disteche 2006; Lin et al. 2007) veya daha yakın zamanda RNA dizilemeyi (Deng et al. 2011) kullanan çeşitli çalışmalarda bu meseleye eğilindi ve memelilerde X-bağlantılı genlerin yukarı-regülasyonuna ilişkin güçlü kanıtlar elde edildi. Ancak veriler dikkatle yorumlanmayı gerektiriyor.

X kromozomunun otozomlardan daha yüksek oranda dokuya-özgü (çoğunlukla cinsiyetsel gelişimle ilgili) gen içerdiği gerçeğinden ötürü karışıklıklar ortaya çıkıyor; her iki cinsiyette de belli bir dokudaki veya hücre tipindeki kapatılmış (susturulmuş) olan X-bağlantılı genlerin oranı, otozomlarda olduğundan daha yüksek oluyor (Ellegren & Parsch 2007; Meisel et al. 2012). Bunun hesaba katılması gerekiyor. Hem erkek hem de dişi hücrelerinde X-bağlatılı genlerin yukarı-regülasyonlu ifadelenmesi, kanıtların ağırlığıyla güçlü bir şekilde desteklenmesine rağmen, dozaj telafisi meselesinde sıkça olduğu gibi durum karmaşık. Her ne kadar X:otozom ifadelenme oranı tutarlı bir biçimde >0,5 olsa da 1,0’a ulaşmıyor (Deng et al. 2011; Lin et al. 2011). Bunun nedeni, yukarı-regülasyonun tüm X-bağlantılı genlere uygulanmaması olabilir. Belki de sadece daha dozaja-duyarlı genler yukarı-regüle ediliyordur (Pessia et al. 2012); bu, yukarı-regülasyonun her seferinde tek bir genle belirlendiği bir evrimsel modele de uyar (Fig. 1).

X-bağlantılı genlerle ilgili yanıtlanmayı bekleyen çok sayıda soru var ve gündeme getirdikleri meseleler, çok daha yoğun biçimde incelenen bir soru olan X-kromozomu inaktivasyonu ile ilgili; ki bu makalenin geri kalanı da bunu konu alıyor. Belki de en büyük aciliyet, genlerin genel, kromozom-çapında bir mekanizma tarafından mı yukarı-regüle edildiği, farklı genlerin farklı mekanizmalar mı benimsediği, yoksa her iki etkenin de mevcut mu olduğuna karar verme gereksinimidir. D. melanogaster‘de dozaj telafi mekanizmasını açığa çıkarmaya çalışırken de benzer meselelere eğilinmiştir ve her ne kadar sineklerde kullanılan erkeğe-özgü sürecin memelilerde işlemesi pek muhtemel olmasa da, geniş çapta incelenmiş olan bu model organizmadan alınacak önemli dersler olduğuna kuşku yoktur.

1.3. Dişi Memelilerde İnaktif Bir X’in Tanımlanması

1949 yılında Barr ve Bertram, cinsiyet kromatini cisimciğini tanımladı; bu, çeşitli memeli türlerindeki sadece dişi hücrelerinin çekirdeklerinin içinde bulunan ve ışık mikroskopu altında görülebilen bir yapıydı. Cinsiyetsel anormalliklerin incelenmesinde işe yaradığı anlaşılan bu yapının, iki dişi X kromozomunun birinden türediği ise Ohno ve çalışma arkadaşlarının 1959’daki çalışmasına dek anlaşılamadı (bkz. Ohno 1967). Bundan kısa süre sonra 1961’de Mary Lyon, dişi farelerde X-bağlantılı kürk rengi genlerinin ifadelenmesi konusunda genetik deneyler yaptı. Ayrı ayrı dişi farelerde kürk renginin bu değişken yama işi (mozaik) görüntüsünün kalıtım şablonlarını açıklamak için Lyon, her bir dişi hücresindeki iki X kromozomundan birinin, gelişimin başlarında sabit bir şekilde inaktive edildiği hipotezini ileri sürdü (Lyon 1961). Günümüzde Barr cisimciği olarak adlandırılan cinsiyet kromatini cisimciği, inaktif X kromozomunun sitolojik göstergesiydi. X-bağlantılı enzim glukoz-6-fosfat dehidrojenazın polimorfizmi bakımından heterozigot olan dişilerin deri fibroblastları kullanılan zekice deneyler, tek hücreden çoğalan kolonilerde (klonlar) iki olası allelden sadece birinin ifadelendiğini gösterdi; böylece ainaktif durumun bir hücre neslinden sonraki nesile kalıtılabilirliğini göstermiş (Davidson et al. 1963) ve dişi insanlarda X inaktivasyonunun gerçekleştiğini doğrulamış (Beutler et al. 1962) oldu. Çok sayıda X kopyası taşıyan (karyotipleri 47XXX veya 48XXXX gibi olan) dişi insanlarda X inaktivasyonu konusunda yapılan daha sonraki çalışmalar, biri aşan tüm X kromozomlarının inaktifleştirildiğini gösterdi. Bu olgu, eğer bir birey n sayıda X kromozomuna sahipse, n – 1 tanesinin inaktive edileceğini söyleyen “n – 1 kuralı” olarak genelleştirildi (Ohno 1967). Bu kural, X-kromozomu anöploidileri ile ilişkilendirilen dikkat çekici ölçüde hafif klinik semptomları da açıklar. X inaktivasyonu hipotezi, dişi hücrelerinde X-bağlantılı genlerin ifadelenme tuhaflıkları için bir açıklama sunmayı sürdürdü ve ilk öne sürüldüğünden bu yana özünde değişmeden kaldı. Ama yaklaşık son 50 yıl, onun işlemesini sağlayan moleküler mekanizmaları anlamaya çalışarak geçti.

2. X İnaktivasyonuna Genel Bakış

2.1. X İnaktivasyonu Gelişimsel Olarak Regüle Edilir

Dişi memelilerde X inaktivasyonu gelişimsel olarak düzenlenir. Erken evre zigotta her iki X kromozomu da etkindir (Epstein et al. 1978) ve inaktivasyon, pluripotent (çok-yetili) durumdan hücresel farklılaşma ile aynı zamanda ilerler. Normalde, hücrelerin annesel (Xm) veya babasal (Xp) X-kromozomunu inaktifleştirme olasılıkları eşittir. Bunun istisnası, keselilerde ve erken evre preimplantasyon fare embriyolarında görülen, hep Xp’nin inaktifleştirildiği damgalanmış X inaktivasyonudur. İkinci vakada, damgalanmış Xp inaktivasyonu ilk farklılaşan soylarda, yani ekstra-embriyonik trofektoderm (TE) ve primitif endoderm (PE) hücrelerinde olur, ama embriyoyu ortaya çıkaran iç hücre kütlesi (ICM) hücrelerinde inaktif X yeniden aktive edilir. X inaktivasyonunun geri alınması, gelişen ilksel germ hücrelerinde de (PGC) görülür ve gamette X kromozomunun yeniden aktif olduğunu garantiler. Fig. 4 dişi farede X inaktivasyonu ve yeniden aktivasyonu döngüsünü göstermektedir.

Figür.4: X inaktivasyonu ve yeniden-aktivasyonu döngüsü.

2.2. Kromozom Susturma, Kromatin Modifikasyonunun Birden Fazla Düzeyini Gerektirir

X-kromozomunun sessizleştirilmesi kromatin yapısı düzeyinde sağlanır; hepsi de kalıcı bir fakültatif (istemsel) heterokromatik yapıya katkıda bulunan histon kuyruklarının modifikasyonu, varyant histonların dahil edilmesi ya da edilmemesi, bazı CpG adalarının DNA metilasyonu ve yüksek-düzeyli kromatin katlanışının yeniden organize edilmesi yollarıyla gerçekleştirilir. Sistemin içinde gereğinden fazlalık hâli vardır ve susturmanın tüm yönleri için tüm bileşenler mutlaka var olmak zorunda değildir (Sado et al. 2004). Kromatin modifikasyonu katmanları, Bölüm 4.4’te ayrıntılandırıldığı gibi organizma gelişimi boyunca kademeli olarak oluşur. Hepsi birlikte, hücre bölünmesinin çok sayıda çevrimi boyunca inaktif X’in dengeli yayılımını garantilerler.

2.3. Bazı Genler X İnaktivasyonundan Kaçar

X inaktivasyonu, X kromozomunun çoğunu etkiler ama bazı genler susturmadan kaçar (Berletch et al. 2011). Bunların arasında, erkek mayozu sırasında Y kromozomu ile çiftlenen ve PAR veya XY çiftlenme bölgesi denilen, X kromozomu üzerindeki küçük bir bölgedeki genler de bulunur (Fig. 1). Bu bölgede konumlanan genler dozaj telafisine gereksinim duymaz çünkü hem erkeklerde hem de dişilerde iki kopya bulunur.

X inaktivasyonundan kaçan hem Y-bağlantılı homologları olan hem de olmayan diğer genler de karakterize edilmiştir. Bunlar insan X-kromozomundaki genlerin toplamda ∼%15’idir (Carrel & Willard 2005). İlginç bir şekilde, bu genlerin çoğu kromozomun kısa kolunda (p kolu da denir) yer alır; bu kol, evrimsel süreçte X kromozomunun yakın zamanda edindiği bir parçadır. Farelerle yapılan çalışmalar, bazı kaçakların organizma gelişiminin erken evrelerinde inaktifleştirilebildiğine ve gelişim sırasında gerçekleşen kademeli yeniden aktifleşterme görülebildiğine işaret etmiştir (Böl. 4.6). Keselilerde, incelenen genlerin çoğunun bir ölçüye kadar X inaktivasyonundan kaçtığı bulunmuştur. Bu, organizma gelişimi boyunca susturmayı sürdürmede bir başarısızlığı yansıtıyor olabilir ve muhtemelen bu türlerdeki inaktif X (Xi) üzerindeki CpG adası metilasyonunun yokluğuyla alâkalıdır.

2.4. X İnaktivasyonu, Bir Ana Şalter Lokus Tarafından Regüle Edilir: X İnaktivasyon Merkezi (Xic)

Klasik genetik çalışmalar, X inaktivasyonunun, X inaktivasyon merkezi (Xic) olarak adlandırılan tek bir cis-etkir  ana şalter lokus tarafından yönetildiğini göstermiştir (Latince “cis-” öneki “yanında, aynı yanda” anlamında gelir; “trans-” önekinin karşıtı olarak da kullanılır; “cis-etkir” sıfatı, yanındaki genlere yani aynı kromozomdaki genlere etkiyen genler için kullanılır). Hem cis‘teki X kromozomunun susturulması, hem de rastgele X inaktivasyonunun doğru ve uygun başlatılışını garantilemek için Xic’e gerek olduğu gösterilmiştir. Daha yakın zamanda yapılan çalışmalar, moleküler düzeyde Xic’yi karakterize etmiştir. Bu lokus, Xist (X-inaktife-özgü yazım) denilen büyük bir kodlamayan RNA üretir; Xist‘in cis‘te bağlanmak ve yazımının yapıldığı kromozomun tüm uzunluğu boyunca birikmek gibi benzersiz bir özelliği vardır (Fig. 5) (Brown et al. 1991; Brockdorff et al. 1992; Brown et al. 1992). Kromozomun Xist RNA ile kaplanması, X-kromozomu susturulması için tetikleyici olur (Lee et al. 1996; Penny et al. 1996; Wutz & Jaenisch 2000). Şimdiye dek yapılan çalışmalar, bunun en azından kısmen, kromatin modifiye edici komplekslerin Xist-aracılı görevlendirilmesi yoluyla gerçekleştiğine işaret etmektedir (Fig. 5A).

Figür.5: Xist RNA tarafından tetiklenen kromozom-çapında aşamalı heterokromatinleşme.

İkinci bir kodlamayan RNA olan Tsix de Xic bölgesinde konumlanmıştır (Lee et al. 1999) ve Xist ifadelenmesini düzenlemede önemli bir rol oynar. Tsix, Xist geni ile çakışır, ama yazımı antisens yönünde yapılır; o yüzden adı tersten yazılmış Xist‘tir.

Filogenetik incelemeler, kodlamayan Xist RNA’nın protein kodlayan bir yazım olan Lnx3‘ten evrildiğini ortaya çıkarmıştır (Duret et al. 2006). Lnx3 geni, protein kodlama kapasitesini başka omurgalı türlerinde ve ayrıca keseli memelilerde korumuştur. Bu ikinci bulgu hiç beklenmedik bir şeydi çünkü keselilerdeki X inaktivasyonunun bariz benzerlikleri, kromozom susturmanın Xist‘in doğrudan bir homologu tarafından yönetildiği varsayımına yol açmıştı. Yıllar süren arayıştan sonra, yakın zamanda yapılan bir çalışma, keselilerde cis-etkir bir kodlamayan RNA lokusu olan Rsx‘in (sessiz X’teki RNA) bağımsız olarak evrildiğini açığa çıkardı; bu lokus, keseli türlerde Xist‘in işlevinin aynısını yerine getiriyor (Grant et al. 2012). Xist RNA gibi, Rsx RNA’nın yazımı spesifik olarak Xi’den yapılıyor ve cis‘teki X kromozomunun uzunluğunu kaplıyor.

3. X İnaktivasyonunun Başlatılması

3.1. Damgalanmış X İnaktivasyonu ve Rastgele X İnaktivasyonu

Bir X kromozomunu inaktifleştirme kararının sıkı bir düzenleme altında olması gerekir. Erkek hücreleri sahip oldukları tek X kromozomunu susturmaktan kaçınmalıdır; dişi hücreleri ise her iki kromozomlarını da susturmaktan veya her iki kromozomlarıı da aktif tutmaktan kaçınmalıdır. İki farklı düzenleme modunun  işlemekte olduğu gösterilmiştir. Damgalanmış X inaktivasyonu modu babasal X kromozomunu sustururken, rastgele X inaktivasyonu modu rastgele olarak ya babasal ya da annesel X kromozomunu inaktifleştirir. Keseli memeliler sadece damgalanmış modu kullanır. Eteneli (plasentalı) memelilerden bazıları (örn. fare), eksta-embriyonik hücre soylarında damgalanmış modu, fetüs hâline gelen embriyo bölümünde (İng. embryo proper) ise rastgele modu kullanır (Fig. 2). Başta tavşan ve insan olmak üzere diğer türler, sadece rastgele X inaktivasyonu sergiler (Okamoto et al. 2011). Bu çeşitlilik kısmen embriyonik genom aktivasyonunun zamanlamasındaki farklılıklarla bağlantılı olabilir; farede nispeten erken şekilde iki hücrelik evrede olurken, insanlarda dört ilâ sekiz hücrelik evrede olur.

X inaktivasyonunun başlatılışının incelenmesinde önemli model sistemler, erken evredeki fare embriyoları ve bu farelerin ICM’sinden türetilen embriyonik kök (ES) hücrelerdir. XX ES hücreler özellikle kullanışlıdır çünkü hücreler farklılaşmaya sevk edildiğinde, rastgele X inaktivasyonunun başlatılışını in vitro (deney tüpünde) yineler. Damgalanmış X inaktivasyonunun başlatılışını yineleyen in vitro model ise şu anda mevcut değildir.

3.2. Damgalanmış X İnaktivasyonunun Regülasyonu

Babasal damgalı X inaktivasyonu ilk olarak bir keselide gözlemlenmiştir (Sharman 1971). Ardından, damgalanmış X inaktivasyonunun, fare embriyolarının TE ve PE’lerinde gerçekleştiği gösterilmiştir (Takagi & Sasaki 1975). Damgalanmış X inaktivasyonunda, X’in durumunu yöneten, X’in kökenindeki ebeveyndir; yani kaç tane X kromozomu veya kromozom kümesi olursa olsun, annesel değil babasal X kromozomları inaktifleştirilir. XY erkeklerdeki tek X’in hep anne kökenli olduğuna ve dolayısıyla damgalanmış dokularda inaktifleştirilmediğine dikkat ediniz.

O hâlde damganın doğası nasıldır? Xist ifadelenmesi incelemeleri, morula evresindeki fare embriyolarındaki Xm alleli üzerinde baskılayıcı bir damga olduğuna işaret etmiştir. Bu damga Xist ifadelenmesini engelleyerek, X kromozomunu aktif tutar (bkz. Fig. 4). Çekirdeksel aktarım deneyleri, baskılayıcı Xist damgasının oosit olgunlaşması sırasında yerleştirildiğini göstermiştir (Tada et al. 2000). Damganın moleküler temeli bilinmemektedir ama çoğu diğer damgalanmış genin tersine DNA metilasyonu gerekli değildir (bkz. Barlow & Bartolomei 2014: Memelilerde Genomik Damgalama).

Zigotta Xp’nin tercihli inaktivasyonu için ileri sürülen kuramlardan biri, erkek mayozunun pakiten evresi sırasında oluşturulan XY iki-değerlisinin susturulmasının (mayotik cinsiyet-kromozomu inaktivasyonu – MSCI; Huynh & Lee 2003) kalıntısı olduğuydu. Yeni yapılan çalışmalar buna karşıttır. Birincisi, MSCI’nın ayrı ve Xist‘den bağımsız bir mekanizma olduğu gösterilmiştir; hem cinsiyet kromozomlarının hem de otozomların üzerindeki çiftlenmemiş kromozomal bölgelerin varlığıyla pakitende tetiklenir (Turner et al. 2006). İkincisi, erken evre zigotlardaki çok sayıda X-bağlantılı genin ifade çözümlemesi, Xp susturmanın, zigotik Xp Xist ifadesine yanıt olarak de novo gerçekleştiğini göstermiştir (Okamoto et al. 2005).

Zigotik gen aktivasyonunun eşiğinde (iki ilâ dört hücrelik evrede) başlayan babasal Xist ifadesi (ve sonucunda oluşan Xp susturma), Xp Xist allelinin ifadelenmeye hazır olduğuna işaret eder (Fig. 6). Xist başlatıcıdaki (İng. promoter) CpG bölgelerin bölgeye-özgü bir demetilasyonu, spermatojenez sırasında gerçekleşir (Norris et al. 1994) ve bunun için önemli olduğu düşünülmektedir.

Figür.6: Gelişimin başlarında Xist gen regülasyonu.

Xist‘in bir antisens regülatörü olan Tsix geni, damgalanmış X inaktivasyonu için gereklidir çünkü majör başlatıcının silinmesi, annesel gametle aktarıldığında erken evre embriyonun ölümüyle sonuçlanır; babasal gametle aktarıldığında ise ölümcül değildir (Lee 2000). Ölümcüllük, uygunsuz Xm Xist ifadelenmesine (yani hem XmY hem de XmXp embriyolarda aktif bir X kromozomu koruma başarısızlığına) atfedilebilir gibi görünmektedir. Tsix RNA ifadesinin birincil damga mı olduğu, yoksa damgayı sürdürmek için sonradan mı işlediği bilinmemektedir.

3.3. Rastgele X İnaktivasyonunun Regülasyonu: Sayma

X inaktivasyonunun rastgele modunda, hücreler Bölüm 1.3’te tanımlanan n – 1 kuralını kullanır; yani her diploid kromozom kümesinde biri hariç tüm X kromozomları inaktifleştirilir. X kromozomlarının sayısını algılayan süreç genellikle sayma olarak adlandırılır. Birden fazla X kromozomunun bulunduğu yerde, aktif ve inaktif X kromozomlarının seçimi -seçme olarak adlandırılır- normalde rastgeledir. Ancak bu kararın tarafsızlığını bozarak rastgele olmayan veya asimetrik X inaktivasyonuna neden olan etkenler bulunmaktadır. Seçme süreci ayrıca Bölüm 3.4’te ele alınmıştır ama bu kısım formalite icabıdır çünkü sayma ile seçmenin ayrılmaz şekilde bağlantılı olması gerektiği bellidir.

Sayma ve seçme için çok sayıda farklı model önerilmiştir (Fig. 7). Xist‘in keşfinden önce geliştirilen eski modeller, tek bir X inaktivasyon merkezine bağlanıp baskılamaya yetecek sınırlı miktarlarda bulunan tek bir otozomal olarak kodlanmış engelleme faktörüne başvuruyordu (Rastan 1983). Bu modelde, X inaktivasyonu varsayılan (İng. default) yolak olup, diploid hücrelerde tek bir X kromozomunda (aktif X’te) engelleniyordu. Birden fazla sayıda X kromozomu olan hücrelerde seçme, engelleme faktörünün belli bir X inaktivasyon merkezi alleline bağlanma olasılığıyla belirleniyordu.

Figür.7: Rastgele X inaktivasyonunun regülasyonu için modeller.

Benzer bir model iki faktöre başvuruyordu: Otozomal olarak kodlanmış bir engelleme faktörü ve X-kodlamalı bir yeterlilik faktörü (Gartler & Riggs 1983). Engelleme faktörünün, tek bir X inaktivasyon merkezi üzerindeki yeterlilik faktörünü devre dışı bırakmaya yeterli olduğu önerildi. Diğer X inaktivasyon bölgeleri, X inaktivasyonunun başlangıcına götüren yeterlilik faktörü tarafından bağlanılabilirdi. İlk başta Xist‘in keşfinden önce geliştirilmesine rağmen, Xist’in antisens regülatörü olan Tsix‘in silinmesinden doğan deneysel gözlemleri açıklamaya yardım etmesi için bu model yeniden benimsendi (Lee & Lu 1999).Üçüncü ve daha çağdaş bir model ise otozomal faktörlerin, örneğin Tsix‘i indükleyerek, Xist baskılanmasını başlattığı, X kromozomunun da bu baskılayıcılarla mücadele eden Xist geni aktifleştiriciler ürettiği bir stokastik sürece başvurur. Ortaya çıkan mücadele, hücreler farklılaşmaya başlarken modüle edilen Xist geni aktivasyonu olasılığı doğurabilir. Bu model, her durumda tek bir X’in aktifliğinin sürdürülmesinin bir stokastik olasılığını öngörür ama başta XX hücrelerdeki X kromozomlarının ikisinin veya hiçbirinin inaktivasyonu olmak üzere, doğru olmayan X inaktivasyon şablonlarınının, erken bir aşamada tekrar ayarlanmasını garantileyen kontrol ve geri-besleme mekanizmalarına başvurur. Bu kısmen, iki X kromozomundan birinin üzerindeki aktivatörü (etkinleştiriciyi) kodlayan lokusa susturma yayılır yayılmaz, X-bağlantılı etkinleştiricilerin düzeylerinin sınırlayıcı hâle gelmesine atfedilebilir (Nora & Heard 2009).

Bu modellerin birbirlerini dışlaması gerekmez ve dahası, yeni deneysel bulguları hesaba katmak için evrilmeye devam etmektedir. Şu anki duruma göre, modellerin hiçbirinin varolan verilerin bütününü tatminkâr biçimde açıklayabildiği söylenemez ama yine de hem mevcut verileri tümleşikleştirmek, hem de yeni deneysel doğrultular belirlemek için kullanışlı bir çerçeve sunmaktadırlar.

Rastgele X inaktivasyonunda Xist regülasyonu için eksiksiz bir model henüz bulunmamış olsa da, Xist‘i baskılayan yolaklar ile aktifleştiren yolaklar arasında incelikle dengelenmiş bir mücadele olduğu konusunda görüş birliği artmaktadır. Belli bir allelde Xist yukarı-regülasyonunu başlatma ve sonra sürdürme kararı, geri-besleme ve/veya ileri-besleme döngüleriyle takviye edilebilir.

Genetik incelemeler, antisens gen Tsix‘in önemli bir Xist baskılayıcı olduğunu göstermiştir. Rastgele X inaktivasyonunda, Xist ifadelenmesinde ve başlamasıyla birlikte  X kromozomu üzerinde Tsix‘in yazımı yapılır. Tsix başlatıcılar (İng. promoters), Xist lokusunun hemen aşağısında yer alır (Fig. 8). Antisens yazım tüm Xist lokusuna yayılarak, majör Xist başlatıcının hemen yukarısını sonlandırır. Tsix-aracılı baskılama için Xist başlatıcı bölgesi boyunca antisens yazımı gereklidir (Ohhata et al. 2008). Ayrıntılı moleküler mekanizmalar tam olarak anlaşılmamıştır ama Xist başlatıcının histon modifikasyon durumundaki bir şalterle (Sado et al. 2005; Navarro & Avner 2010) ve de novo DNA metiltransferaz Dnmt3a görevlendirilmesiyle (Sun et al. 2006) ilgili olduğu düşünülmektedir.

Figür.8: X inaktivasyon merkezi bölgesindeki genler ve düzenleyici öğeler.

Farklılaşan Tsix olmayan (İng. null) XY ES hücrelerde Xist ‘in kuvvetli yukarı-regülasyonu gözlemine dayalı olarak, Tsix‘in saymada bir rol oynadığı düşünülmektedir. Bununla birlikte, bütün Tsix olmayan ES hücre soyları bu etkiyi göstermez (uyuşmazlığın nedenleri açıklanmayı beklemektedir) ve dahası, farklılaşmamış XY ES hücrelerde Tsix silinmesi, bariz Xist geni yukarı-regülasyonuna yol açmaktadır.

Bu gözlemler, başka yolakların Xist baskılanmasına katkıda bulunduğuna işaret eder. Yakın zamanda yapılan çalışmalar, başta Oct4, Nanog, Sox2 ve Rex1 olmak üzere, pluripotent (çok-yetili) hücre devresiyle bağlantılı yazım faktörleri için önemli bir rolü vurgulamıştır (Donohoe et al. 2009; Navarro et al. 2010). Bu baskılayıcı etkiler, Tsix ifadelenmesinin başlatılışıyla, doğrudan Xist‘in baskılanmasıyla ve ayrıca Xist aktivatörü Rnf12 düzeylerinin azaltılmasıyla yönetilir. Farklılaşma başlangıcında pluripotentlik faktörlerinin düzeyi hızla azaldığından, Xist lokusundaki düzenleyici denge aktivasyon yönüne kayarak, Xist ifadelenmesi ile hücre farklılaşması arasındaki bağlantı için makul bir açıklama sağlar.

Polikomb ailesi baskılayıcıları da (Bölüm 4.4 ve 4.5’te ayrıntılandırıldı), hem Tsix hem de PRC2 Polikomb yolağını etkileyen mutasyonları olan hücrelerde gözlemlenen sinerjistik (birbirini artıran) etkilere dayanarak, Xist baskılanmasına dahil edilir (Shibata et al. 2008). Bunun çok-yetililik (pluripotentlik) faktörü yolağıyla mı bağlantılı olduğu, yoksa üçüncü bir Xist baskılama yolağını mı temsil ettiği henüz bilinmemektedir.

Xist ifadelenmesinin X kromozomu-kodlamalı etkinleştiricilerinin varlığı ve konumu, poliploid ES hücrelerin ve XX ES hücrelerdeki tek bir X kromozomu üzerindeki bilinen Xist düzenleyici öğeleri kapsayan bir silinmenin analizi yoluyla öngörülmüştür (Monkhorst et al. 2008). Bu çalışma, bilinen ilk Xist etkinleştiricisi olan ubikitin E3 ligaz Rnf12‘nin tanımlanmasına doğrudan yol açmıştır (Jonkers et al. 2009). Rnf12‘nin aşırı-ifadelenmesi, XY ES hücrelerde Xist ifadelenmesini başlatırken, Rnf12 silinmesi farklılaşan XX ES hücrelerde Xist yukarı-regülasyonunu geciktirir.

Rnf12 geninin konumunun Xist‘in hemen yukarısında olması, X inaktivasyonunun bir X kromozomu üzerindeki yayılımının Rnf12‘yi baskıladığı, Rnf12 protein düzeylerini düşürdüğü ve böylelikle geri kalan X kromozomlarının uygunsuz  ainaktivasyonu olasılığını düşürmeye hizmet ettiği bir geri-besleme döngüsü düşüncesini desteklemektedir. Rnf12, hem Xist hem Tsix geninin başlatıcı bölgelerinde bulunan çok-yetililik faktörü Rex1’in ubikitin-aracılı ayrıştırılması için bir E3 ligaz olarak işler. Dolayısıyla, Rex1’in Rnf12-aracılı ayrıştırılması, eşzamanlı olarak Xist‘i etkinleştirebilir ve Tsix‘i baskılayabilir (Gontan et al. 2012).

Her ne kadar Rnf12’nin Xist gen etkinleştirilmesinde önemli bir rolü olduğu açıksa da, Rnf12 olmayan XX ES hücrelerin, biraz gecikmeyle de olsa, Xist‘i yukarı-regüle edebildikleri gerçeği, ilave etkinleştiricilerin varlığına ve ayrıca muhtemelen X kromozomu üzerinde kodlandığına işaret eder. Böyle bir rol, Xist lokusunun hemen yukarısında konumlanan bir ncRNA olan Jpx‘e atfedilmiştir (Tian et al. 2010). Jpx RNA işlevinin mekanizması, henüz tam olarak anlaşılmamış olmasına karşın, susturucu protein CTCF’yi Xist lokusundan tahliye ettiğine ilişkin taze kanıtlar bulunmaktadır (Sun et al. 2013). Benzer biçimde, Jpx‘in hemen yukarısındaki Ftx lokusu tarafından üretilen bir başka ncRNA, Xist geni etkinleştirilmesine dahil edilir (Chureau et al. 2011). Xist baskılanmasına ve Xist etkinleştirilmesine katkıda bulunduğu bilinen lokuslar ve yolaklar, Figur 8‘de özetlenmiştir.

3.4. Rastgele X İnaktivasyonunun Regülasyonu: Seçme

XX hücrelerde, belli bir hücrede hangi X kromozomunun inaktifleştirileceğinin seçimi normalde rastgeledir. Ancak, belli Xic allelleri için heterozigot olan hayvanlar, allellerden biri veya diğeri yönünde bir taraflılık sergileyebilir. Bunları ele almadan önce, birincil ve ikincil rastgele-olmayan X inaktivasyonu arasındaki ayrımı öncelikle yapmak önemlidir. Birincil rastgele-olmayan X inaktivasyonu, rastgele X inaktivasyonu başlatıldığı anda gerçekleşen seçme adımındaki bir taraflılıkla ilgilidir. Öte yandan ikincil rastgele-olmayan X inaktivasyonu, belli bir X kromozomunu inaktif X olarak tayin etmiş olan hücrelere karşı seçimin bir sonucu olarak gerçekleşir. Bu ikinci süreç seçme ile sıkı bağlantılı değildir ama bir X kromozomundaki mutasyonlar, yabani-tip alleli inaktifleştiren hücrelere seçimsel bir dezavantaj sunduğunda yaygın olarak gerçekleşir. Örnekler arasında, Duchenne kas distrofisi gibi ciddi genetik bozuklukların taşıyıcılarında görülen ikincil rastgele-olmayan X inaktivasyonu bulunmaktadır. Gözlemlenen gücre seçilim etkileri, mutant proteinin işlevine bağlı olarak, gelişen embriyonun bütünü düzeyinde ya da spesifik doku veya hücre tiplerinde gerçekleşebilir.

Birincil rastgele-olmayan X inaktivasyonunun belgelenmiş ilk örneği, farklı fare soylarındaki “X kontrol öğesi” (İng. X controlling element -Xce) varyantlarını belirleyen klasik genetik çalışmalarından gelmiştir (Cattanach 1974). Xce, fare X kromozomu üzerinde Xic’nin yaklaşık konumuna haritalandırılarak, iki lokusun sinonim olabileceğine işaret etmiştir. Xce’yi Xist‘in hemen aşağısındaki bir bölgeye konumlandıran daha güncel çalışmalar bunu doğrulamıştır. Rastgele-olmayan X inaktivasyonunun altında yatan varyasyonun moleküler temeli ise belirlenmeyi beklemektedir.

Birincil rastgele-olmayan X inaktivasyonu, çeşitli Xic allelleri için heterozigot olan hayvanlarda da gözlemlenmiştir; Xist ve Tsix‘in işlevsel tahliline yönelik gen hedefleme deneylerinde ortaya konmuştur. Bu çalışmalardan beliren ortak tema, X inaktivasyonu için seçilme olasılığını artıran alleller, ya antisens Tsix yazım düzeylerini düşüren ya da sens Xist yazım düzeylerini yükselten mutasyonlarla ilişkilendirilmesidir (Lee & Lu 1999; Nesterova et al. 2003). Seçmenin, bir Xist RNA uç-birleştirme şalteriyle bağlantılı olduğuna ilişkin taze kanıtlar da vardır (Royce-Tolland et al. 2010). Rastgele X inaktivasyonu düzenlenmesi modelleri bağlamında, taraflı seçim, belli bir allel üzerindeki Xist baskılayıcılar ile Xist etkinleştiriciler arasındaki dengenin bozulması olarak görülebilir.

Her iki allele de eşit erişim varken, sayma/seçme mekanizmasının nihayetinde sadece tek bir allelle ilişkilendirilmesiyle sonuçlanan simetri-kırılması olayı o hâlde nedir? Akla gelen fikirlerden biri, X inaktivasyonu başlatıldığı anda Xic alleller arasındaki trans-etkileşimlerin bununla ilgili olabileceğidir. Özellikle belirtmek gerekirse, üç boyutlu (3D) floresan in situ hibritleştirme (FISH; Xu et al. 2006; Augui et al. 2007) ve lokus etiketleme deneyleri (Masui et al. 2011), Tsix başlatıcıya ve Xist‘in birkaç yüz kilobaz yukarısında bulunan Xpr adlı bir bölgeye yakın aracılar tarafından iletilen Xic allelleri sık ilişkilendirilmelerini göstermiştir. Şu anki modeller, başlangıçtaki trans-etkileşimlerin oluşumu için Xpr gerektiğini varsayar; dolayısıyla Tsix bölgesindeki aracıları kolaylaştırır. Bu trans-etkileşimlerin, bir allelden diğerine faktörlerin değiş-tokuşuna aracılık ederek, simetri kırılımı için bir fırsat sağladığı önerilmiştir (bkz. Fig. 7 @ Dekker & Misteli 2014).

3.5. Embriyojenezin Başlarında X İnaktivasyon Regülasyon Modlarının Değişikliği

Erken evre fare embriyoları, damgalanmış regülasyon modundan, rastgele regülasyon moduna şalteri nasıl geçirir (bkz. Fig. 4)? Yakın zamana dek, damgalanmış ve rastgele X inaktivasyonunun başlayışının her ikisinin de hücresel farklılaşmayla bağlantılı olduğu düşünülüyordu (Monk & Harper 1979). Dolayısıyla, trofektoderm ve primitif endoderm soylarının, ilk farklılaştıklarında Xist üzerindeki ebeveynsel damgalara yanıt olarak Xp’lerini inaktifleştirdikleri düşünülüyordu. Gastrulasyon ile fetüs hâline gelen embriyo bölümünü (İng. embryo proper) oluşturan üç germ soyunun, önce Xist damgasını sildiği ve sonra rastgele X inaktivasyonuna geçtiği düşünülüyordu  (Fig. 6). Yakın zamanda elde edilen veriler ise Xp inaktivasyonunun, klivaj evresi embriyolarda hücresel farklılaşmanın başından önce gerçekleştiğini gösterdi ve bu ICM’nin prekürsörleri de dahil olmak üzere tüm hücrelerde oluyordu (Fig. 6) (Mak et al. 2004; Okamoto et al. 2004). Dolayısıyla, trofektoderm ve primitif endodermde damgalanmış X inaktivasyonu, erken evre klivaj embriyolarda oluşan X inaktivasyon şablonunun kalıntısıydı. Başlangıçtaki bu damgalanmış Xp inaktivasyonu dalgasını geri çevirmek için ICM hücrelerin bir program tetiklemesi gerekir; böylelikle onu izleyen rastgele X inaktivasyonuna zemin hazırlarlar. Xp inaktivasyonunun geri çevrilmesinin temeli bilinmemektedir ama Xp Xist ifadelenmesini baskılayan ICM’ye özgü bir programla ilgili olabilir (bkz. Böl. 5.1).

3.6. X İnaktivasyon Regülasyonu Mekanizmalarında Evrimsel Varyasyon

Şimdiye dek, X inaktivasyonunun başlayışı üzerine yapılan çalışmalarda birincil model sistem, laboratuvar faresi olmuştu. Ancak yakın zamanda yapılan çalışmalar, fare çalışmalarından çıkarılan sonuçların, sanıldığı kadar geniş çapta geçerliliği olamayabileceğine işaret etti (Okamoto et al. 2011). İnsan preimplantasyon embriyolarının analizi, erken preimplantasyon gelişimi sırasında XIST’in erkek embriyolarda X kromozomundan ve dişi embriyolarda her iki X kromozomundan yukarı-regülasyonunu gösterdi. Bu şablon, erkeklerin XIST ifadelenmesini bitirdiği, dişilerin de sadece bir X kromozomundan ifadelendirdiği geç blastokistlerde çözüldü. İnsan embriyolarında erken XIST ifadelenmesi, kromozom susturma ile balantılı değildir; bu, X-bağlantılı genlerin ifadelenmesi gereğiyle tutarlıdır. Bir başka varyasyon ise tavşanlar ile yapılan deneyler yoluyla ortaya çıkarılmıştır; dişi preimplantasyon embriyoları, hücrelerin ∼%25’inde her iki allelden Xist ifadelenmesi yapar. Bu vakada, Xist ifadesi kromozom susturma ile bağlantılı olup, ya uygunsuz biallelik (iki allelli) Xist ifadesini düzeltip geri alabilen bir kontrol mekanizmasına ya da her iki X kromozomunu da susturan XX hücrelerin kaybıyla sonuçlanan hücre seçilim olaylarına işaret eder (Okamoto et al. 2011). İlerisi için önemli amaçlardan biri, çeşitlilik sergilediği görülen bu sistemlerde korunumlu özellikler olup olmadığını belirlemek olacaktır çünkü onların temelde yatan mekanizmalara işaret etmesi muhtemeldir.

4. İnaktif Durumun Yayılımı ve Sürdürülmesi

4.1. Xist RNA, Gen Susturma ve Heterokromatin Derleme

Xist geni ve onun RNA ürününün, hem cis‘te X inaktivasyonunu başlatan şalter, hem de susturmanın kromozomunher yanına yayılma aracı olduğuna ilişkin güçlü kanıtlar bulunmaktadır. Kanıt, şunlara işaret eden deneylerden gelmektedir: (1) Xist, sadece Xi’den ifadelenme açısından benzersizdir; (2) Preimplantasyon embriyolarda X inaktivasyonu sırasında Xist RNA düzeyleri dramatik biçimde artar; (3) Xist yukarı-regülasyonu X inaktivasyonundan önce gerçekleşir ve onun olması için mutlak bir gereklilik gibi görünmektedir; (4) Xist RNA interfaz çekirdeklerinde Xi ile birlikte-konumlanır ve iki metafaz X kromozomundan biri boyunca dağıtılır (bkz. Fig. 5B) (5) Xist-içeren transgenler,otozomlara yerleştirildiğinde, cis‘teki otozomu Xist RNA ile kaplayabilir ve heterokromatin-benzeri, yazımsal olarak suskun bir kromatin yapının benimsenmesini başlatabilir. Bu bulgular, Xist RNA’nın heterokromatin oluşumunu ve yazımsal susturmayı tetiklemek için gerekli ve yeterli olduğuna işaret eder. Ancak, X inaktivasyonunun “sürdürülmesi” için devam eden Xist ifadelenmesi gerekli değildir. Örneğin, insanın X-bağlantılı genlerin susturulması, korunan insan Xi kromozomu üzerinde Xist ifadelenmesinin yitirildiği insan:kemirgen somatik hücre hibritlerinde sürdürülür (Brown & Willard 1994). Bu mesele Bölüm 5’de daha ayrıntılı ele alınmıştır.

Xist RNA’nın cis‘teki Xi ile ilişkilendiği ve her yanına yayıldığı mekanizma(lar) ve kromatin yapısı ile gen susturmaya değişiklikler getiren mekanizmalar, hâlâ ayrıntılarıyla anlaşılmış değildir. Şunu biliyoruz ki, Xist RNA molekülünün farklı bölgeleri, gen susturmadan ve X kromozomu boyunca yayılımdan sorumludur. Fare ES hücrelerinde, tanımlanmış silinmeler taşıyan Xist RNA moleküllerinin işlevlerinin sınanabileceği, indüklenebilen bir Xist ifadelenmesi sistemi ile yapılan deneyler, susturmanın korunmuş bir yineleme dizilimine, molekülün 5′ ucunda konumlanan A-yinelemesine atfedilebileceğini; X’in kaplanmasının ise molekülün geri kalanına saçılmış olan dizilimlerle iletilebileceğini  göstermiştir (Wutz et al. 2002). Bu gözlemler, Xist RNA yayılımı ile kromozom susturma işlevlerinin mekanistik olarak ayrılabilir olduğunu gösterir.

4.2. Xist RNA’nın Yayılımı ve Kromozom Susturma

Xist RNA’nın Xi ile ilişkisi seçimseldir. Aktif ve ökromatik kalan PAR boyunca veya sentrik heterokromatinde bulunmaz. Dahası, metafaz kromozomlarının analizi, gen zengini G-açık (İng. G-light) bantlar ile bağlaşık gibi görünen bir bantlı yerelleşme sergiler (Duthie et al. 1999). Bölünen hücrelerde, Xi ile Xist RNA ilişkisi, hücreler anafaza girdiğinde yitirilir. G1’in başında yavru hücrelerde hemen yeniden sentezlenir. Xist RNA, interfaz çekirdeğindeki çekirdeksel matriks ile sıkı ilişkilidir ve mikrokokal nükleaz tarafından kromatin kaldırılmasını takiben yerelleşme korunur; ki bu da Xist RNA’nın, altta yatan DNA dizilimleriyle doğrudan irtibat kurmadığına işaret eder (Clemson et al. 1996).

Bir dişi somatik hücresinde yaklaşık 2 × 103 Xist RNA molekülü vardır (Buzin et al. 1994). Yazım (transkript), bölünen hücrelerde tahminen 6-8 saatlik yarı-ömürle nispeten kararlıdır; ağırlıklı olarak mitoz yoluyla ayrışmanın bir sonucu olarak gerçekleşen dönüşüm ile uyumlu bir rakamdır. Ancak, yazımsal engelleyicilerin varlığında Xist RNA dönüşümü engellenebilir; çünkü canlı hücrelerde GFP-etiketli Xist yazımları kullanılan yeni bir çalışmada, Xist RNA için nispeten hızlı bir dönüşüm oranı belirlenmiştir (Ng et al. 2011).

O hâlde, Xist RNA yerelleşmesini düzenleyen faktörler hakkında ne bilinmektedir? İlginç bir bağlantı, SAF-A/hnRNPU proteininin çözümlenmesinden çıkmıştır. Başlangıçta bir hnRNP protein ve çözünmez çekirdeksel iskelenin başlıca bileşenlerinden biri olarak tanımlanan SAF-A/hnRNPU, ilk olarak, XX somatik hücrelerde interfaz Xi bölgesinden proteinin fazlalığını gösteren hücre görüntüleme çalışmaları yoluyla X inaktivasyonu ile bağlantılandırılmıştır (Pullirsch et al. 2010). Bu gözlem, Xist RNA’nın çekirdeksel matriks ile ilişkilendirilmesi ile uyumludur. Daha yeni veriler, SAF-A/hnRNPU’nun genetik parçalanmasının, nükleoplazma yoluyla Xist RNA’nın dağıtımına neden olduğuna işaret ederek, Xist RNA yerelleşmesinde bir rolü akla getirmiştir (Hasegawa & Nakagawa 2011). Dahası, biyokimyasal çözümlemeler, hnRNPU/SAFA’nın RNA bağlanma bölgesinin doğrudan Xist RNA ile etkileşim yaptığına işaret etmiştir (Fig. 9A).

Figür.9: X inaktivasyonu yayılımına dahil olan faktörler.

Xist RNA yerelleşmesine dahil edilen ikinci bir faktör, hem Xic’deki hem de Xist RNA’daki DNA öğelerine bağlanma yetisi olan iki-işlevli bir protein olduğu düşünülen YY1 yazım faktörüdür (Fig. 9A) (Jeon & Lee 2011; Thorvaldsen et al. 2011). Xist genindeki bağlanma öğelerinin, Xist RNA parçacıklarının Xi ile kenetlenmesine aracılık eden nükleasyon (çekirdeklenme) bölgeleri olarak işlediği ileri sürülmüştür.

4.3. X İnaktivasyonunun Yayılımını Kolaylaştıran Destekleyici Öğeler

Xist RNA transgenleri otozomlar üzerinde işlemesine rağmen, otozomal susturma, X kromozomunun susturulmasından daha verimsizdir. Otozomların Xist-aracılı susturmaya nisbî duyarsızlığı, ilk olarak, X:otozom translokasyonlarındaki gen susturmayı analiz eden klasik genetik çalışmalarında raporlanmıştır. Özellikle belirtmek gerekirse, sessiz kromatinin otozomal kromozom kolu boyunca yayılımının translokasyonlar arasında değişken olduğu ve boyutça sınırlı olduğu bulunmuştur. Bu, Xist RNA’nın başlangıçtaki yayılımına direnç gösteren otozomlara ve ilişkilendirilen gen susturmaya atfedilebilir; en azından bazı vakalarda (Popova et al. 2006). Başka vakalarda, sınırlı susturma, X inaktivasyonunun başındaki verimli yayılmayı takiben, otozomlar üzerinde susturmanın atipik uzun vâdeli sürdürülmesinden kaynaklanıyor gibi görünmektedir (Cattanach 1974).

Otozomlardaki azaltılmış susturma, X kromozomu üzerinde, başlangıçta “yol istasyonları” veya “destekleme öğeleri” (Gartler & Riggs 1983) olarak adlandırılan ve X inaktivasyonunun yayılımını/sürdürülmesini yükselten veya iyileştiren dizilimler olduğu fikrine yol açmıştır. Daha yakın zamanda, yaygın bir dağılmış yineleme ailesi olan L1 uzun-serpiştirilmiş yinelemelerin, “yol istasyonu” öğesine iyi adaylar oldukları ileri sürülmüştür (Lyon 2003). Bu yineleme dizilimleri, fare ve insan genomlarında yaygındır ama X kromozomu boyunca özellikle sık karşılaşılırlar. Bundan başka, LINE-1 öğelerinin en yaygın oldukları yer, insan ve fare genomlerının daha yoğun, gen fakiri, G-bantlı bölgeleridir ki bu, onların bir şekilde yazımsal susturma ile ilişkilendirilen bir kromatin konformasyonunu destekleyebileceklerini akla getirir. Bu fikri destekleyecek şekilde, otozomlar üzerinde ve X otozom translokasyonlarında konumlanan Xist transgenlerinin aracılık ettiği gen susturmanın analizi, büyük gen zengini LINE-1 tükenmiş kromozomal bölgelerinin, X inaktivasyonu yayılımına nispeten dayanıklı olduğuna işaret etmektedir (Popova et al. 2006; Chow et al. 2010; Tang et al. 2010).

Yaygın kanılardan biri, yol istasyonu öğelerinin, Xist RNA-bağlanma bölgeleri ile sinonim olduğudur. L1 LINE öğeleri vakasında, L1 LINE dağılımına karşıt olarak, Xist RNA gen zengini kromozomal bölgelerde yoğunlaştığından, bu muhtemel gözükmemektedir. İlginç bir şekilde, L1 LINE’ların X kromozomu üzerindeki yüksek yoğunluğu, gen zengini bölgeleri bölmüştür ve dolayısıyla onlar ortalama olarak otozomlardan küçüktürler. Bu nedenle fikirlerden biri, L1 LINE bölgelerin, gen zengini bölgelerin içinde Xist RNA’nın cis‘te yayılımını destekleyecek biçimde, kromozomun yüksek-mertebeli topolojik katlanışını etkilediğidir (Popova et al. 2006; Tang et al. 2010). Sentezlenme bölgesinden (yani Xist lokusu) X kromozomu alanına Xist RNA’nın yayılımının veriminin hem o alanın 3-boyuttaki toplam konfigürasyonuna, hem de alan içinde Xist lokusunun nasıl konumlandığına bağlı olduğunu hatırlamak önemlidir. X inaktivasyonunun ilk oluştuğu anda, spesifik olarak inaktif X kromozomu üzerinde gerçekleştirilen büyük bir L1 LINE yazım patlaması olduğunu, RNA FISH analizi göstermiştir (Chow et al. 2010). L1 yazımı, örtüşen yazımların ve kısa RNA’ların üretiminin dahil olduğu bir mekanizma yoluyla doğrudan susturma ile bağlantılandırılmıştır ama cis‘te X inaktivasyonunun yayılımını kolaylaştırmada da ayrıca bir rol oynuyor olabilir. Sitolojik analizin sağladığının ötesinde, Xist RNA bağlanma bölgelerine ilişkin bilgi şu anda mevcut değildir ve bağlanma bölgelerini nükleotit çözünürlüğüne yakın haritalamak için bir yöntem geliştirilmesi, ilerisi için önemli bir amaçtır.

4.4. İnaktif X’in Heterokromatik Yapısı: Kromatin Modifikasyonları ile Bağlantı

Yapılan ilk ışık mikroskobu çalışmalarından itibaren, Xi’nin heterokromatin ile paylaştığı özellikler olduğu fark edilmiştir. Sentromerlerde ve çevresinde konstitütif (yapısal) heterokromatinin bulunması gibi, interfaz boyunca Xi görünür hâlde ve bariz biçimde yoğunlaştırılmış (Barr cisimciği olarak) kalır ve DNA’sı genellikle S-fazının sonlarında kopyalanır. Xi’nin “fakültatif” (istemsel) heterokromatinden oluştuğu söylenir.

Xi ile konstitütif (yapısal) heterokromatin arasındaki başka paralellikler, hem metafaz kromozomları boyunca hem de interfaz çekirdeklerinde histon modifikasyonlarının ve varyantların dağılımını incelemek için dolaylı immünoflorasan mikroskopisinin kullanımından çıkarılmıştır. Hem insan hem de fare hücrelerindeki inaktif X kromozomunun fakültatif (istemsel) heterokromatini, asetillenmiş histon H4 içinde fakirleştirilmiştir (Jeppesen & Turner 1993) ve böylelikle konstitütif (yapısal), sentrik heterokromatini andırır. Bu, inaktif X kromozomunun spesifik bir tür histon modifikasyonu ile işaretlendiğinin ilk gösterilişiydi. (Histon modifikasyonları ve onların işlevleri Allis et al. 2014 makalesinde tanımlanmıştır.) Bunun ardından çeşitli laboratuvarlarda yapılan deneyler bu gözlemleri doğruladı ve dört çekirdek histonun hepsinin (H2A, H2B, H3 ve H4) asetillenmiş izoformlarının, interfaz ve metafaz hücrelerde hem konstitütif (yapısal) hem de fakültatif (istemsel) heterokromatin içinde fakirleştirildiğini bir daha gösterdi (Fig. 5B). Özellikle belirtecek olursak, hem sentrik heterokromatin hem de Xi, lizin 4’teki H3 dimetillenmiş ve trimetillenmişte fakirleştirilir (H3K4me2 ve H3K4me3; O’Neill et al. 2008). Asetilasyon gibi, H3K4me2/me3 genellikle yazımsal olarak aktif veya potansiyel olarak aktif kromatinin işareti olarak düşünülür.

Xi üzerinde zenginleştirilen diğer kromatin modifikasyonları arasında, lizin 27’deki H3 trimetillenmiş (H3K27me3) ve lizin 119’daki H2A monoubikitinlenmiş (H2AK119ub1; Fig. 9B) histon modifikasyonları sayılabilir. Bu modifikasyonlar, Polikomb baskılayıcı kompleksleri tarafından katalizlenir (bkz. Grossniklaus & Paro 2014). Ayrıca insanda ve başka bazı türlerde, normalde konstitütif perisentrik heterokromatinle ilişkilendirilen H3K9me3 zenginleştirilmesi de mevcuttur. Farede H3K9me3 değil, H3K9me2 zenginleştirilmesi gözlemlenmiştir. Bu modifikasyonlarla ayrı histon lizin metiltransferazlar (KMT’ler) ilişkilendirildiğinden, farklı türlerdeki Xi heterokromatinde temel bir farklılığı temsil ediyor gibi görünmektedir. Kromozom yoğunlaşması ile ilişkilendirilen bir histon modifikasyonu olan yükselmiş H4K20me1 de Xi üzerinde gözlemlenmiştir (Kohlmaier et al. 2004). Son olarak, spesifik histon modifikasyonlarına ilaveten, varyant bir histon olan macroH2A, Xi heterokromatinde zenginleştirilir (Costanzi & Pehrson 1998) ve bunun tersine farklı bir varyant olan H2A.bbd spesifik olarak Xi üzerinde fakirleştirilir (Chadwick & Willard 2001).

Kültürlenmiş insan hücrelerindeki Xi boyunca histon modifikasyonlarının dağılımlarının dikkatli bir çözümlemesi, sistemin karmaşıklığı hakkında aydınlatıcı olmuştur (Chadwick & Willard 2003). H3K9me3 ve H3K27me3/H2AK119ub1, Xi boyunca tanımlanan ama örtüşmeyen bölgelerde zenginleştirilir. Dolayısıyla, histon asetilasyonunun yitiminden farklı olarak, bu modifikasyonlardaki zenginleştirme Xi’nin bölgesel, yani komple olmayan bir özelliğidir. İlginç bir şekilde, H3K27me3’te zenginleştirilen bölgeler, Xist RNA’da ve varyant histon macroH2A1.2’de de zenginleştirilir. Tersine, H3K9me3’te zenginleştirilen Xi bölgeleri, ayrıca heterokromatin proteini HP1’in (metillenmiş H3K9’a bağlandığı bilinir) ve H4K20me3’ün (konstitütif, sentrik heterokromatin ile ilişkilendirilen bir işaret) artmış düzeylerini sergiler. Önemli bir nokta, interfaz hücrelerde Barr cisimciğinin ve metafaz hücrelerde inaktif X’in immünolekelemesinin (immünohistokimyasal boyama; İng. immunostaining), aynı birlikte-lekeleme şablonu sergilemesidir; bu da, farklı bölgelerin hücre çevrimi boyunca tutulduğunu akla getirir.

Konstitütif sentrik kromatin, metillenmiş DNA’da, birincil olarak CpG dinükleotitlerdeki 5′-metilsitozinde  zenginleştirilir (bkz. Li & Zhang 2014). Bu, yazımsal etkinliğinin düşük düzeyi ile uyumludur. Belki de şaşırtıcı şekilde, Xi üzerindeki CpG metillenme düzeyi, toplamda genomun geri kalanından önemli ölçüde yüksek değildir. Bununla birlikte, sessiz genlerle ilişkilendirilen CpG adacıkları yüksek düzeyde metillenmiştir ve deneysel kanıtlar, inaktif durumun durağanlaştırılmasında DNA metillenmesinin önemli bir rol oynadığına işaret eder. Xi üzerindeki CpG metillenmesindeki toplam düşüşün, intronlardaki, intergenik (genler-arası) bölgelerdeki ve muhtemelen yaygın yineleme öğelerindeki metilasyonun düşmesine atfedilebileceği bellidir.

Çoğu durumda, inaktif X kromozomunun kromatin özellikleri, ya metafaz kromozomlarının ya da inerfaz hücrelerdeki Barr cisimciğinin immünoflorasan analiziyle belirlenir. Ancak, histon modifikasyonlarındaki yerelleşmiş değişiklikler de X inaktivasyonu sürecinin bazı evrelerinde önemli roller oynayabilir. Böyle değişiklikler, yüksek çözünürlüklü mikroskopiyle veya kromatin immünopresipitasyonu (ChIP) yaklaşımlarıyla belirlenebilir. Xist lokusunu çevreleyen kromatinin ChIP çözümlemesi, farklılaşmamış ES hücrelerdeki metillenmiş H3K9 ve H3K27 zenginleştirilmesiyle karakterize edilen Xist geninin >340 kb 5′ kadar uzanan bir bölge belirlemiştir (Rougeulle et al. 2004). Hücreler farklılaşırken ve X inaktivasyonu ilerlerken, hipermetilasyon hafifler. Bu bölge içindeki alanlar, asetillenmiş H3 ve H4’te zenginleştirilir (O’Neill et al. 1999). Sürmekte olan incelemeler, Xic bölgesindeki bu yerelleşmiş histon modifikasyonlarının, X inaktivasyon sürecini ne ölçüde yürüten erken, ettirgen olaylar ya da süregiden bir kromatin yeniden-modelleme sürecinin (muhtemelen esas) bileşenleri olan akış aşağı olaylar olduklarını açığa çıkaracaktır.

Türlerarası fare çaprazlarında, aktif (Xa) X kromozomuna göre inaktif (Xi) üzerinde spesifik modifikasyonların/ faktörlerin yüksek-çözünürlüklü haritalarını belirlemek için yakın zamanda yapılan önemli bir yenilik olan ChIP (ChIP-seq) ile elde edilmiş kromatin parçalarına uygulanmış yüksek-çıktılı dizileme, tekil-nükleotit polimorfizmlerinin (SNP) kullanımıyla birleştirilmiştir. Bu yaklaşım kullanılarak, Xi üzerinde H3K27me3’ün büyük bloklar hâlinde olduğu, başlatıcılara, gen gövdelerine ve genlerarası bölgelere genişçe dağıldığı gösterilmiştir (Marks et al. 2009).

4.5. Xi Üzerindeki Kromatin Modifikasyonlarının Enzimolojisi

X inaktivasyonu veya H3K4 demetilasyonu sırasında merkez histonların (HDAC) deasetillenmesinden sorumlu enzimler henüz bilinmemektedir. Histon modifikasyonlarını yerlerine yerleştirmeden sorumlu enzimler hakkında daha çok şey bilinmektedir. H2AK119u1 ve H3K27me3, sırasıyla Polikomb baskılayıcı kompleksler PRC1 ve PRC2 tarafından  Xi üzerinde biriktirilir (Silva et al. 2003; de Napoles et al. 2004; Grossniklaus & Paro 2014). PRC2’nin Xi’ye katılımı Xist’e bağlıdır ve bunun PRC2 bileşenlerinin, Xist RNA’nın A-yineleme öğesi ile doğrudan etkileşimiyle iletildiği ileri sürülmüştür (Zhao et al. 2008). Ancak PRC2’nin A-yineleme öğeleriyle doğrudan etkileşiminin öykünün bütünü olması pek muhtemel değildir çünkü Xi’ye PcG katılımı erken fare preimplantasyon gelişimi sırasında gerçekleşmez (Okamoto et al. 2004) ve A-yineleme öğesinin silindiği transgenik Xist RNA verimsiz de olsa hâlâ PRC2’yi katabilir (Kohlmaier et al. 2004). PRC1 kompleksinin Xi’ye katılımı, kısmen CBX2/4/7 merkez proteininin kromo-bölgesinin, PRC2 kompleksi tarafından yerine yerleştirilen H3K27me3 histon modifikasyonu ile etkileşimine atfedilebilir (bkz. Fig. 5 @ Grossniklaus & Paro 2014). Ayrıca, CBX proteinlerinin RYBP alt-birimleri tarafınfan değiştirildiği varyant RYBP-PRC1 komplekslerini katan bir PRC2’den bağımsız yolak da vardır (Tavares et al. 2012).

İnsanda ve farede Xi üzerindeki sırasıyla H3K9me3 ve H3K9me2’yi katalizleyen spesifik KMT enzimleri, henüz formal olarak tanımlanmamıştır ama genomda başka bölgelerde bu modifikasyonları oluşturan enzim sistemleri iyi tanımlanmıştır (Cheng 2014). Xi üzerindeki CpG adacıklarının DNA metilasyonu, de novo metiltransferaz Dnmt3b gerektirirken, Dnmt3a ve eklenti (İng. accessory) protein Dnmt3L olmasa da olur (Gendrel et al. 2012). Çoğu Xi CpG adacığında DNA metilasyonu için gereken ilave bir faktör, kromozom organizasyonu ve dinamiğinde rolü olan kondensin ve kohezin kompleksleri bileşenlerini kapsayan SMC (kromozomların yapısal idamesi; İng. structural maintenance of chromosomes) süper-ailesinin atipik bir üyesi olan Smchd1 proteinidir (Blewitt et al. 2008). Smchd1 proteini Xi üzerinde zenginleştirilir ve homozigot mutant fareler, X-bağlantılı genlerin eksik susturulmasına atfedilebilecek dişiye-özgü embriyo ölümcüllüğü sergiler. Bununla birlikte, Smchd1’in CpG adacık metilasyonu ve susturmayı etkilediği mekanizma belirlenmeyi beklemektedir.

4.6. Xi Üzerinde Yüksek-Mertebeli Kromatin Yapısı

Xi kromatin her ne kadar sıkça “yoğun” olarak tanımlansa da, dikkatli mikroskopik çözümleme ile X’e özgü DNA problarıyla etiketlenmiş Xa ve Xi kromozomlarının 3D yeniden-yapılandırımı, aralarındaki farkın birim hacim başına kromatin miktarından ziyade, bir şekil meselesi olduğunu akla getirmektedir (Eils et al. 1996; Splinter et al. 2011). Diğer çekirdeksel yapılara göre Xi’nin konumu da önemli olabilir. Örneğin, Barr cisimciğinin çekirdeksel sınıra ve/veya çekirdekçiğin sınırına yerelleştiği sıkça gözlemlenmektedir.

İnterfez çekirdekteki Xist RNA bölgelerine göre Xi kromozomu üzerindeki genlerin 3D organizasyonunun analizinden daha ileri kavrayışlar edinilmiştir (Chaumeil et al. 2006). Xist RNA’nın X kromozomu üzerindeki yaygın yineleme dizilimlerini içeren ve içinde RNA polimeraz II’nin (Pol II) fakirleştirildiği bir bölgeyi tanımladığı bulunmuştur. X inaktivasyonunun tesis edilmesi esnasında ve gen susturma ile başa baş olarak, X-bağlantılı genler, Xist RNA bölgesinin dışında kalan konumlardan, bölge sınırındaki veya içindeki alanlara alınır. A-yineleme bölgesi silinmiş olan susturma eksiklikli Xist RNA transgenleri, bir Xist RNA bölgesi oluşturabilir ama genleri almada başarısız olur. Xist RNA bölgesinin, X kromozomu üzerindeki yaygın yineleme öğelerinin konumuna karşılık geldiğinin bulunması, metafaz kromozomları üzerinde Xist RNA’nın LINE-1 öğelerine göre karşıt bir konumda olduğu düşünülürse biraz paradoksaldır (Böl. 4.3). Bu noktanın çözüme ulaştırılması için daha fazla araştırma gerekmektedir.

X inaktivasyonunda daha yüksek mertebeden kromozom organizasyonunun önemli bir rolü olduğu, kromozom mimarisiyle potansiyel ilgisi olan proteinlerin, özellikle de Smchd1 (bkz. Böl. 4.5) ve hnRNPU/SAFA’nın (Böl. 4.2)  tanımlanmasıyla da ileri sürülmüştür. Ek bir çekirdeksel iskele faktörü olan SATB1 de Xist-aracılı susturma için yeterlilik verilmesine dahil edilmiştir (Agrelo et al. 2009); ama SATB1 nakavtlı farelerde bir X inaktivasyon kusurunun olmaması nedeniyle rolü yakın zamanda sorgulanmıştır (Nechanitzky et al. 2012).

3D kromozom topolojisini çözümlemede yeni teknolojiler, Xi üzerindeki daha yüksek mertebeli kromozom organizasyonunu daha da aydınlatmaktadır. Dekker and Misteli (2014) makalesinde tanımlanan ve onların Fig. 5‘inde açıklanan 4C yöntemi (kromozom üzerinde belirtilen konumlar arasındaki temas sıklığını ölçer), XX somatik hücrelerde Xi ve Xa allellerini ayırmak için SNP’ler ile birlikte kullanılarak, Xa üzerindeki konumların dahil olduğu tercih edilen uzun-menzilli temasların, Xi üzerinde kayıp olduğunu göstermiştir (Splinter et al. 2011). Xist silinmesi her ne kadar X-bağlantılı genlerin yeniden aktivasyonuyla sonuçlanmasa da, bu etkileşimler Xist lokusunun silinmesiyle kısmen geri gelmiştir (bkz. Böl. 4.1). Benzer biçimde, X inaktivasyonunun başlangıcı sırasında Xic’in düzenleme ortamını incelemek için 5C yöntemi uygulanmıştır ve Xist ile Tsix‘in ayrı topolojik bölgelerin içinde bulundukları gösterilmiştir (Nora et al. 2012; bkz. Fig. 7 @ Dekker & Misteli 2014). Bu yeni yöntemlerin uygulanması, özellikle de geleneksel florasan mikroskopisinin çözünürlük limitini genişleten 3D yapılandırılmış ışıklandırma mikroskopisi gibi ileri mikroskopi yaklaşımlarıyla birleştirildiğinde Xi yapısını anlayışımızda önemli ilerlemeleri kolaylaştıracaktır (Schermelleh et al. 2008).

4.7. X İnaktivasyonuna Yol Açan Olayların Sıralaması

Farklılaşan XX ES hücreleri, X-kromozomu inaktivasyonunun dinamiğinin incelenmesi için paha biçilmez bir model sistem sağlamıştır. Farklılaşmamış hücrelerde her iki X kromozomu da aktiftir ve Xist ile Tsix düşük düzeylerde ifadelenir. Artmış Xist RNA düzeyleri ve bir X kromozomunun onunla kaplanması, ilk olarak farklılaşmanın 1-2d’sinden sonra hücrelerin yüksek bir oranında saptanmıştır. Bunu, Xist RNA bölgeleri içinde RNA Pol II’nin hızlı fakirleşmesi ve sonra H3K4me3’ün fakirleşmesi izler (O’Neill et al. 2008). PcG proteinlerinin ilişkilendirilen H3K27 metilasyonu ve H2A monoubikitinasyonuyla katılımı, H3K9 deasetillenmesi ve H3K4 metilasyon yitimi ile birlikte benzer bir zaman diliminde gerçekleşir (Silva et al. 2003; de Napoles et al. 2004; Rougeulle et al. 2004; O’Neill et al. 2008). Xi üzerinde global histon deasetilasyonu ve H3K9me2 birikimi biraz gecikmeli oluşarak, hücrelerin çoğunda 3 ilâ 5.günlerde gerçekleşir (Fig. 10) (Keohane et al. 1996). Bazı modifikasyonların gecikmeli ortaya çıkışı, bunların inaktif durumun oluşumuyla değil de, sürdürülmesi/sabitliği ile ilgili olmalarının muhtemel olduğunu akla getirir. Bu yorum, inaktivasyona giren tekil genlerin başlatıcılarındaki asetillenme ve metillenme şablonlarının, kromozomun tümünün veya geniş alanlarının immünoflorasan analiziyle belirlenenleri yansıttığını varsayar. ChIP  ile yapılan daha önceki incelemeler, durumun aynen öyle olduğunu düşündürmektedir (O’Neill et al. 2008), ama daha ileri deneylerin, örneğin ChIP-seq kullanılarak, yapılması gerekmektedir.

Figür.10: Farklılaşan XX ES hücrelerde olayların sıralaması.

Xi üzerinde varyant macroH2A1.2 histonun birikimi, XX ES hücre farklılaşması sırasında çok daha geç gerçekleşir (Mermoud et al. 1999). Bu varyant histon, karboksi-terminal kuyruğunda 200’den fazla ilave amino asite ve molekül boyunca çeşitli amino asit ikamelerine sahiptir. İlginç bir şekilde, somatik hücrelerde Xi üzerinde macroH2A’yı korumak için Xist RNA ifadelenmesi gereklidir (Csankovszki et al. 1999), ama farklılaşmanın erken evrelerinde macroH2A katılımı için yeterli değildir (Mermoud et al. 1999; Wutz et al. 2002).Xi’ye üç başka faktörün geç katılımı da yeni raporlanmıştır: hnRNPU/SAFA, Ash2l (Pullirsch et al. 2010) ve Smchd1 (Gendrel et al. 2012). Bu gözlemler, Xi üzerinde sessiz kromatin oluşumunun en az iki tane bariz ayrı evresinin olduğuna ve sıralı bir şekilde gerçekleştiğine işaret eder (Fig. 10). ES hücrelerdeki Xi CpG adacıklarının seçimsel DNA metilasyonu, farklılaşma sırasında yavaşça birikir (Gendrel et al. 2012). Bu, gelişen embriyoda Xi üzerindeki Hprt başlatıcının metilasyonunun nispeten geç gerçekleştiğini gösteren eski çalışmalarla (Lock et al. 1987) tutarlıdır; bu bulgu, DNA metilasyonunun inaktif durumun başlangıcı veya yayılımından değil de, kilitlenmesinden veya sabitleştirilmesinden sorumlu olduğu fikrine götürmüştü. Farklılaşan XX ES hücrelerde, CpG adacıklarının büyük bir bölümü, farklılaşmanın 7.gününden önce çok az veya sıfır DNA metilasyonu edinir; bu, Xi üzerinde Smchd1’in ondan önce olmayışına atfedilebilir (bkz. Böl. 4.5). CpG adacıklarının bir kısmı metilasyonu daha erken ve daha yüksek hızla edinir ve o vakalarda metilasyon Smchd1’den bağımsızdır (Gendrel et al. 2012).  Dolayısıyla, koordineli ve dikkatle düzenlenmiş bir olaylar dizisi tarafından Xi üzerindeki kromatin değişikliklerinin gelişim ilerlerken yapıldığı şeklinde bir tablo belirmektedir (Fig. 10).Bu değişikliklerden bazılarının, örneğin histon deasetillenmesinin ve DNA metillenmesinin, hücreler farklılaşmanın değişik yolaklarına ilerlemeye başladıktan sonra gerçekleşmesi dikkat çekicidir. Görünüşe göre, X inaktivasyonunun tamamlanmasından sorumlu program, diğer hücre farklılaşması programlarından bağımsız ilerlemektedir. Bununla birlikte, rastgele X inaktivasyonunun bazı yönlerinin ancak farklılaşma başladıktan sonra ilerleyebildiğini fark etmek önemlidir. Örneğin, “farklılaşmamış” ES hücrelerde Xist transgenlerinin ifadelenmesinin açılması, heterokromatinleşmeyle ilişkilendirilen çeşitli histon modifikasyonlarını ve ayrıca geç S-fazında kopyalanmaya geçişi tetikler (Wutz & Jaenisch 2000), ama macroH2A’nın algılanabilir bir katılımı yoktur; ancak hücreler farklılaşmaya itildikten sonra macroH2A Xist transgenini içeren kromozom üzerindeki Xist RNA ile kolokalize olur (Rasmussen et al. 2001). MacroH2A’nın Xist-kaplamalı kromatik ile ilişkilenmesi, Xist RNA’nın süren varlığına bağlıdır (Csankovszki et al. 1999), ama yazımsal susturma gerektirmez çünkü susturma için gereken bölgeleri olmayan mutant bir Xist RNA ile kaplı kromozomlarda da görülür (Wutz et al. 2002). Dolayısıyla, X inaktivasyonu, sadece bazıları bağımsız olan bir dizi paralel işlemin nihai sonucu olarak görülebilir.

Ayrıca şuna da dikkat etmek gerekir ki, preimplantasyon embriyolarda damgalanmış X inaktivasyonunun oluşumu sırasında farklı bir olay sıralaması da gerçekleşebilir. 16-hücrelik aşamaya kadar H3K27me3’ün zenginleştirilmesinin algılanmaması dikkate değerdir; bu, Xist ifadelenmesinin başlayışından epey geçtir (iki ilâ dört hücrelik aşama; Mak et al. 2004; Okamoto et al. 2004). Bu durum, Xi’ye PRC2 PcG kompleksinin katılımı için spesifik gelişimsel düzenlemeli kofaktörlerin gerektiğine işaret edebilir.

Kromozom çapındaki çeşitli modifikasyonlar ile dişi ES hücrelerde X inaktifleştirilmesinde gerçekleşen gen susturulması arasındaki ilişki açık değildir. X-bağlantılı genlerin ifadelenmesini ölçmek için mikrodiziler (Lin et al. 2007) veya RNA dizileme (Deng et al. 2011) ile elde edilen son veriler, ES hücre farklılaşması sırasında çeşitli zamanlarda tekil genlerin inaktifleştirildiğini, bazı genlerin de inaktivasyondan kaçtığını göstermektedir. Görünüşe göre, X-bağlantılı genlerin çoğu için susturma, ES hücre farklılaşmasının farklı aşamalarında gerçekleşen koşullarla tetiklenmektedir.

4.8. Xist-Aracılıklı Susturma: Çifte Emniyet

Biriken kanıtlar, Xi üzerinde gen susturma yapılmasına katkıda bulunan çok sayıda yolak ortaya koymaktadır. Nükleozomal düzeyde, spesifik çevrim-sonrası (post-translasyonel) modifikasyonların kazancı ve kaybı, farklı histon varyantlarının katılımı ve CpG adacıklarında DNA metillenmesi vardır (Fig. 9B). Daha yüksek mertebeli bir düzeyde, kromatin ilmeklerinin mimarisinde ve çekirdekte kromozom konumları ile kromozom alanlarının yeniden organizasyonunda değişiklikler bulunur; bunlar potansiyel olarak Smchd1, SATB1 ve SAFA/hnRNPU gibi kromozomal proteinlerle iletilir (Fig. 11). Böylece, Xi “çifte emniyetli” bir sistem olarak görülebilir; farklı yolaklar, örtüşen ve fazlalık yaratan roller oynar. Bu çerçeve içinde, farklı yolakların gelişimin spesifik anlarında az ya da çok önemli olması muhtemeldir; bu fikir şu gözlemle desteklenir: Somatik hücrelerin tersine, erken embriyonun hücrelerinde kromozom susturma, sürmekte olan Xist ifadelenmesine bağlıdır. Son olarak, Xi üzerinde spesifik genlerin veya gen altkümelerinin susturulmasına, farklı yolakların farklı şekilde katkıda bulunduğu belirgin hâle gelmektedir. Örneğin, gebeliğin ortalarında ölen dişi Smchd1 eksiklikli embriyolar, Xi üzerindeki lokusların sadece küçük bir kısmında yukarı-regülasyon sergiler (Blewitt et al. 2008). Bu açıdan, Xist ifadelenmesinin başlamasını takiben, tekil Xi genlerinin susturulma zamanlarında önemli ölçüde değişkenlik olduğunu fark etmek önemlidir. Dolayısıyla, tek tek genler bazında farklı X inaktivasyon yolaklarının katkısını hesaba katmak, bir dereceye kadar gerekli olabilir.

Figür.11: Xist-aracılı susturmaya dahil olan faktörler.

Xist-aracılı susturma ile ilgili yolakların belirlenmesi yolunda her ne kadar önemli ilerleme sağlanmış olsa da, kilit faktörlerin bulunmayı bekliyor olması muhtemeldir. Örneğin, susturma işlemini başlatmak için Xist RNA’nın A-yineleme bölgesi ile etkileşen kritik faktörleri henüz bilmiyoruz. Dolayısıyla, bilinen Xi modifikasyonlarının ve ilgili yolakların ikincil olması, henüz karakterize edilmemiş birincil bir mekanizma tarafından oluşturulan susturmaya cevaben gerçekleşmesi olasılığı vardır.

5. X-Kromozomunun Yeniden-Aktivasyonu ve Yeniden-Programlanması

5.1. Normal Gelişimde X Yeniden-Aktivasyonu

İnaktif X kromozomunun susturulmasına katkıda bulunan birden fazla epigenetik modifikasyon katmanı vardır. Bunun sonucunda, baskılanmış durum genellikle yüksek düzeyde durağandır ve onu geri döndürmeye yönelik girişimler deneysel olarak hep başarısız olmuştur. Ancak normal gelişimin ilerleyişinde, tüm X kromozomunun yeniden aktifleştirildiği koşullar mevcuttur. En iyi incelenmiş örnek, gelişen PGC’lerde X inaktivasyonunun geri çevrilmesidir. Farede, PGC’ler gastrulasyondan kısa süre sonra gelişimin yaklaşık 7-8 gününde belirlenir. Bu sırada, embriyonun hücreleri hâlihazırda rastgele X inaktivasyonu yapmış durumdadır. Ardından, gelişen PGC’ler embriyonun arka sindirim kanalı bölgesi boyunca göç eder ve yetişkin gonadlarını meydana getirecek yapılar olan genital çıkıntılara varır. XX PGC’lerin Xi’lerini yeniden-aktifleştirdiği zaman da o zamandır (Monk & McLaren 1981). Bu olay, ebeveynsel damgaların silinmesi ve genom çapında DNA demetilasyonunu içeren daha genle bir epigenetik yeniden-programlama ile aynı zamanda olur (bkz. Fig. 5 @ Barlow and Bartolomei 2014: Memelilerde Genomik Damgalama; ayrıca bkz. Reik & Surani 2014).

PGC’lerde X-kromozomu yeniden-aktivasyonu, çok-katmanlı heterokromatik yapının geri çevrilmesi için özelleşmiş bir mekanizmaya işaret edebilir. Xist RNA ifadelenmesinin bitiminin, X yeniden-aktivasyonu ile bağlaşık olduğu görülmüştür, ama susturmanın XX somatik hücrelerde Xist’den bağımsız olduğu düşünülürse, bunun nedensellik anlamına gelip gelmediği kesin değildir.

PGC’lerin susturma ile ilişkilendirilen tüm belirteçleri oluşturmada başarısız olması ve dolayısıyla yeniden-aktivasyona daha duyarlı olması olasıdır. CpG adacıkları metilasyonunun, farede gelişen PGC’lerde Xi üzerinde gerçekleşmemesine ilişkin kanıt bununla uyum içindedir (Grant et al. 1992).

X yeniden-aktivasyonuna ikinci bir örnek, Bölüm 3.5’te ele alınan blastokist evresi embriyolarının ICM soyundaki damgalanmış Xp inaktivasyonunun geri çevrilmesidir; ki bu da yine daha geniş çaplı genom yeniden-programlama olayları ile ilişkilidir. Bu yeniden-aktivasyon ayrıca Xist RNA’nın bitimi ve susturma ile ilişkilendirilen epigenetik belirteçlerin yitimi ile bağlaşıktır. Bir kez daha, pre-ICM hücrelerin, susturma ile ilişkilendirilen tüm belirteçleri oluşturmada başarısız olması ve dolayısıyla X yeniden-aktivasyonuna daha duyarlı olması olasıdır.

5.2. Deneysel Yeniden-Programlama Sırasında X Yeniden-Aktivasyonu

X yeniden-aktivasyonu, spesifik deneysel koşullar altında da gözlemlenmiştir. Somatik çekirdeklerin döllenmemiş oositlere çekirdeksel aktarımı sırasında ve somatik hücrelerin totipotent hücre tipleri (ES, embryonik germ (EG) veya embriyonal karsinoma (EC) hücreleri gibi (bkz. Tada et al. 2000)) ile kaynaşmasını takiben gerçekleşir. Son olarak, X yeniden-aktivasyonu, XX somatik hücreler indüklenmiş pluripotent kök (iPS) hücrelere dönüştürüldüklerinde gerçekleşir (Maherali et al. 2007).

Çekirdeksel aktarımlı embriyolar, özellikle ilginç bir örnek sunar. Fareler üzerinde yapılan deneyler (Eggan et al. 2000), klivaj evresindeki çekirdeksel aktarımlı embriyolarda Xi üzerindeki belirteç bir genin hızlı yeniden-aktivasyonunu göstermiştir. Buna rağmen, çekirdek X’in eskiden inaktif olduğuna ilişkin bazı anıları korumuştur çünkü klonlanan embriyolarda donör hücre Xi’si aynı zamanda plasentanın trofektoderm hücrelerindeki Xi’dir. Tersine, fetüs hâline gelen embriyo bölümünün (İng. embryo proper) hücreleri rastgele X inaktivasyonu sergiler (see Fig. 12). Tahminen, gelişmekte olan ICM’de gerçekleşen X yeniden-aktivasyonu ve yeniden-programlanması, donör çekirdekten gelen epigenetk bilgiyi baştan ayarlaması için embriyoya ikinci bir şans vermektedir (bkz. Mekhoubad et al. 2012).

Figür.12: Klonlanmış fare embriyolarında X inaktivasyonunun regülasyonu.

Yakın zamanda yapılan çalışmalar, ektopik Xist aktivasyonunun, farelerde çoğaltıcı klonlamanın verimsizliğine önemli bir katkı yapar (Inoue et al. 2010). XY donör somatik hücreler kullanılarak, klonlanmış embriyolarda tek bir Xist alleli aktifleştirilir. Benzer şekilde, XX donör somatik çekirdekleri kullanılarak, Xist allellerinin her ikisi de aktifleştirilir. Xist’in silindiği donör hücrelerin kullanımı, klonlama verimliliğini dramatik şekilde yükseltir. Tahminen, konak oosit, XY ve XX somatik hücrelerdeki aktif X kromozomu üzerinde mevcut olan Xist gen baskılanmasını siler. Bundan şu sonuç çıkar ki, dokunulmamış Xist lokusu olan donör çekirdekler kullanılarak klonlanan embriyolar, eğer somatik Xist baskılanmasının yeniden-programlanması başarısız olursa sadece erken preimplantasyon gelişiminden sağ çıkabilir. Bu da normal XX somatik hücrelerden klonlanan embriyolardan sağ kalanlarında neden ekstra-embriyonik hücre soylarında (normalde X inaktivasyon şablonları iki ilâ dört hücrelik aşamalarda belirlenir) donör hücre Xi’sinin inaktif kaldığını açıklar (Fig. 6).

Her ne kadar, fare somatik hücrelerinin iPS yeniden-programlanması sırasında X yeniden-aktivasyonu gerçekleşse de, insan iPS hücrelerinde durum daha karmaşık görünmektedir. Erken iPS kültürleri bir Xi korur, ama X yeniden-aktivasyonu net kültür koşullarına bağlı olarak daha sonra gerçekleşebilir. Bu muhtemelen, fare ES hücreleri ile epiblast kök hücrelerin (EpiSCs; Bao et al. 2009) kıyaslanmasında da gözlemlenen farklı pluripotentlik düzeyleriyle ilgilidir. İnsan ES hücreleri (hESCs), EpiSC’lere fare ES hücrelerinden daha benzerdir ve bununla uyumlu olarak, XX hESC’ler inaktif bir X kromozomunu korur (Tchieu et al. 2010).

5.3. İndüklenebilir Xist Transgenlerden Öğrenilenler

ES hücrelerde indüklenebilir Xist transgenleri kullanılarak yapılan bir dizi deney, X inaktivasyonunun durağanlığı ile geri çevrilebilirliğini kavrayışımızı çok artırmıştır. İlk olarak, Xist RNA’nın farklılaşmamış ES hücrelerde ve farklılaşmanın çok erken aşamalarında X inaktivasyonu oluşuturabildiği, ancak daha ileri aşamalarda oluşturamadığı (buna “fırsat penceresi” deniyor; Wutz & Jaenisch 2000) gösterilmiştir. Çekirdeksel iskele/matris protein olan SATB1’in ektopik ifadesinin, timik lenfoma ve fibroblast hücrelerde Xist RNA’ya yanıt verme yetisi vermesi (Agrelo et al. 2009), bunun gelişimsel yeterlilik için önemli olan bileşenlerden en az biri olduğuna işaret eder (ayrıca bkz. Nechanitzky et al. 2012). Hücrelerin Xist RNA’ya yanıt verme yetisi, X inaktivasyonunun geri çevrilebilirliğiyle yakından ilgilidir. Dolayısıyla, ES hücrelerde veya erken farklılaşma aşamalarında transgen kapatıldığında susturma geri çevrilir; daha geç farklılaşma aşamalarında veya somatik hücrelerde ise olmaz.

X yeniden-aktivasyonuna ve yeniden-programlamasına dönersek, indüklenebilir transgen verileri, belirlenmiş hücresel ortamlarda, yani farklılaşmamış ES hücrelerde, Xist RNA’nın ifadelenmesi sonlandığı zaman X yeniden-aktivasyonunun gerçekleşeceğini düşündürmektedir. X yeniden-aktivasyonunun gerçekleştiği belgelenen hücrelerin hepsinin (yani PGC’ler, ICM hücreler, iPS, EG ve EC hücreler) pluripotentlik ve plastisite bakımından ES hücrelere benzer olduğunu düşünürsek, Xist ifadelenmesinin bitimi, tüm vakalarda X yeniden-aktivasyonunun ardında yatıyor olabilir.

6. Özet ve Geleceğe Yönelik Düşünceler

Son yıllarda, X inaktivasyonunun moleküler mekanizmasını kavrayışımızda önemli ilerlemeler oldu. Şimdiye dek bu ilerleme, epigenetik araştırmanın ilgili alanlarındaki gelişmelerden beslendi ve de başka alanlardaki gelişmeleri tetikledi. İkincisine bir örnek olarak, Xist‘in X kromozomunu düzenlemesine çok benzer şekilde, bazı damgalanmış gen kümelerinin cis-etkir ncRNA’lar tarafından düzenlendiğine ilişkin artan kanıtlar verilebilir (bkz. Barlow & Bartolomei 2014: Memelilerde Genomik Damgalama). Benzer biçimde, keselilerde ncRNA düzenlemeli X inaktivasyonunun bağımsız evrilişi, ncRNA tarafından cis susturmanın potansiyel genelliğini bir kez daha örnekler. Öte yandan başka çalışmalar, gen susturmada trans‘ta işlev gösteren farklı tiplerde ncRNA’ya işaret etmektedir (örn. HOTAIR [Rinn et al. 2007; Rinn 2014]). İleride yapılacak araştırmalarda Xist ile keseli Rsx ncRNA’lar arasında mekanistik bağlantıların belirip belirmeyeceğini görmek ilginç olacaktır.

Yanıtlanmayı bekleyen pek çok soru kalmıştır. Saymayı ve seçmeyi düzenleyen cis-etkir dizilimlerin ve trans-etkir faktörlerin tanımlanmasında ilerleme sağlanmasına karşın, bunların daha ileri açıklamalarının yapılması, heyecan veren çetin bir iştir. Benzer biçimde, X inaktivasyonunun sürdürülmesinde rol alan kromatin modifiye edici komplekslerden bazılarını, örneğin Polikomb-grubu kompleksleri, bilsek de Xist RNA tarafından tetiklenen kromozom-çapında susturma sağlama sinyali bilinmezliğini korumaktadır. Benzer biçimde, Xi kromatindeki kromozm-çapındaki değişiklikler ile tek tek genlerin susturulması arasondaki mekanistik bağlantıları anlamak zordur. Diğer önemli sorular, susturmanın kromozoma nasıl yayıldığını ve yol istasyonlarının (belki LINE öğelerinin) bu süreçteki ve sessiz durumun durağanlaştırılmasındaki/sürdürülmesindeki rollerini -eğer varsa- anlamaktır. Bu, X inaktivasyonunun bazı hücre tiplerinde ve gelişim aşamalarında geri alınıp, başka yerlerde aslında geri alınamaz olmasından doğan ilginç soruyla ilgili olabilir. Bu sonuncu soru, daha geniş ve çok önemli olna, genom plastisitesinin ve gelişim süresince yeniden-programlamanın anlaşılması meselesi ile ilgilidir. Nihayet, eski bir hipotezin, yani erkeklerde ve dişilerde tek aktif X üzerindeki genlerin ifadelenmesinin yukarı-regülasyonunun yakın zamandaki doğrulanışı, X inaktivasyonunun işlediği bağlamın yeni bir manzarasını ve memelilerde dozaj telafisinin gerçek karmaşıklığının daha iyi bir kavrayışını sunmuştur.

Kaynak ve İleri Okuma

Etiket
  • Projelerimizde bize destek olmak ister misiniz?
  • Dilediğiniz miktarda aylık veya tek seferlik bağış yapabilirsiniz.
  • Destek Ol
Yorum Yap (0 )

Yorum yapabilmek için giriş yapmalısınız.

Bunlar da ilginizi çekebilir

Bağış Yap, Destek Ol!
Projelerimizde bize destek olmak isterseniz,
Patreon üzerinden
bütçenizi zorlamayacak şekilde aylık veya tek seferlik bağışta bulunabilirsiniz.
E-Bülten Üyeliği
Duyurulardan e-posta ile
haberdar olmak istiyorum.
Reklam Reklam Ver
Arşiv